Slavomφr RAKOUSK▌¹ a Eva TEJKLOV┴²

¹┌stav molekulßrnφ biologie rostlin Akademie v∞d ╚eskΘ republiky, BraniÜovskß 31,
370 05 ╚eskΘ Bud∞jovice, ╚eskß republika
² AGRITEC, V²zkum, Ülecht∞nφ a slu₧by s.r.o., Zem∞d∞lskß 16,
787 01  èumperk, ╚eskß republika

 V rßmci projektu GA ╚R Φ. 521/97/1135 "InzerΦnφ mutageneze u lnu" se v letech 1997-99 pracoviÜt∞ ┌stavu molekulßrnφ biologie rostlin Akademie v∞d ╚eskΘ republiky v ╚esk²ch Bud∞jovicφch a AGRITEC, v²zkum, Ülecht∞nφ a slu₧by s.r.o., èumperk zab²vala problematikou v²voje vlastnφho postupu p°enosu cizφch gen∙ do rostlin lnu a mo₧nostφ jeho praktickΘho vyu₧itφ k navozenφ d∞diΦn²ch zm∞n (mutacφ) potencißln∞ vyu₧iteln²ch ve Ülecht∞nφ tΘto plodiny. Tento v²zkumn² zßm∞r byl mimo jinΘ podmφn∞n skuteΦnostφ, ₧e u lnu byly stßvajφcφ metody p°enosu gen∙ prost°ednictvφm bakteriφ Agrobacterium tumefaciens mßlo ·ΦinnΘ. Obtφ₧nΘ je zejmΘna vytvo°enφ vhodnΘho systΘmu selekce v prosp∞ch geneticky pozm∞n∞n²ch (transformovan²ch) jedinc∙.

Vlastnφm pokus∙m o p°enos cizφch gen∙ (transgenozi) p°edchßzelo obdobφ, ve kterΘm byly ov∞°ovßny nejvhodn∞jÜφ podmφnky pro regeneraci rostlin ze segment∙ klφΦnφch rostlin, typy a koncentrace lßtek (antibiotik) slou₧φcφch k nßslednΘmu odstran∞nφ bakteriφ a lßtky usnad≥ujφcφ v²b∞r transformant∙. Pro v²voj transformaΦnφ techniky i studium p°enosu gen∙ byl zvolen zjednoduÜen² konstrukt zaΦlen∞n² do vektorovΘ bakterie A. tumefaciens, kter² mimo genu pro rezistenci k antibiotiku hygromycinu (znaΦka umo₧≥ujφcφ v²b∞r transformovan²ch rostlin i molekulßrnφ d∙kaz p°enosu) obsahoval pouze zesilovacφ sekvence promotoru 35S. Toto uspo°ßdßnφ umo₧nilo jednak vyu₧φt dan² konstrukt pro v²Üe zmφn∞nΘ studijnφ ·Φely, ale i pro praktickΘ aplikace. ZaΦle≥uje-li se toti₧ odpovφdajφcφ Φßst vektoru (oznaΦovanß jako T-DNA) do rostlinnΘho chromozomu, pak p°φsluÜnΘ mφsto - "gen", kam se zabuduje, Φasto vy°adφ z Φinnosti. To se navenek projevφ jako mutace. V tomto p°φpad∞ nenφ tedy t°eba k jednorßzovΘmu navozenφ d∞diΦnΘ zm∞ny v rostlin∞ pou₧φvat mutagenu (chemickΘ lßtky, zß°enφ). Lze takΘ oΦekßvat, ₧e by spektrum zm∞n mohlo b²t ΦßsteΦn∞ odliÜnΘ od zm∞n navozen²ch klasickou mutagenezφ.

V²chozφm materißlem byly steriln∞ vyp∞stovanΘ klφΦnφ rostliny lnu. Pro pokusy jsme vybrali zßstupce jak olejn²ch typ∙ (odr∙da Areco, a novoÜlecht∞nφ NLN 245), tak p°adn²ch ln∙ (odr∙da Jitka). V pr∙b∞hu °eÜenφ projektu byla na pracoviÜti ┌MBR AV ╚R vyvinuta novß metodika transformace lnu, je₧ oproti stßvajφcφm technikßm umo₧≥uje ·Φinn∞jÜφ selekci transformant∙. V r. 1998 bylo n∞kolik set takto zφskan²ch rostlin lnu p°evedeno do zeminy a dßle p∞stovßno ve sklenφku, izolovan∞ od jin²ch rostlin. V pr∙b∞hu kultivace rostlin T1/R1 generace nebyly s v²jimkou v²skytu omezenΘho poΦtu jedinc∙ s odchylkami zbarvenφ a morfologie kv∞tnφch Φßstφ a t°φ liniφ se snφ₧enou fertilitou pylu nalezeny v²razn∞jÜφ morfologickΘ odchylky od rostlin kontroly. Zφskanß semena byla pou₧ita na ja°e nßsledujφcφho roku k v²sevu na pole. Hlavnφ nßplnφ projektu v r. 1999 bylo vyhledßvßnφ a charakterizace potencißln∞ mutantnφch jedinc∙ v populaci rostlin T2 a R2 generace p∞stovan²ch v polnφch podmφnkßch. Pokus byl realizovßn na p∞stebnφch plochßch spolu°eÜitelskΘho pracoviÜt∞ AGRITEC èumperk, s.r.o. Byl zalo₧en a veden na zßklad∞ p°φsluÜnΘho povolenφ Ministerstva ₧ivotnφho prost°edφ. Celkem bylo v polnφch podmφnkßch testovßno 927 liniφ odvozen²ch od 3 kultivar∙ lnu. Vzorky dalÜφch 82 liniφ s mal²m poΦtem jedinc∙ byly p∞stovßny ve sklenφku. V rßmci rostlin T2 a R2 generace byly nalezeny odchylky od kontrolnφch rostlin v barv∞ kv∞tnφch Φßstφ (v r∙znΘ frekvenci byly zjiÜt∞ny celkem u 31 liniφ), barv∞ a morfologii semen (16/27), v dΘlce v∞tvφ (14), v²Üce stonku (4), ranosti (24) a vitalit∞ pylu (3). U osmi liniφ byli nalezeni jedinci s ΦßsteΦn²mi poruchami tvorby zelenΘho listovΘho barviva - chlorofylu. Celkem bylo popsßno 13 kategoriφ morfologick²ch odchylek v rßmci 127 liniφ, p°iΦem₧ n∞kterΘ kategorie odchylek se vyskytovaly spoleΦn∞ v rßmci tΘ₧e linie.

V pr∙b∞hu projektu byla rovn∞₧ vyvinuta vlastnφ metodika izolace deoxyribonukleovΘ kyseliny - DNA z rostlinn²ch pletiv, poskytujφcφ DNA v kvalit∞ vyu₧itelnΘ pro polymerßzovou °et∞zovou reakci (PCR). SouΦasn∞ byla ov∞°ovßna vhodnost r∙zn²ch technik detekce transgenu (genu pro hygromycinfosfotransferßzu - hpt) v pletivech transformovan²ch rostlin. Jako nejvhodn∞jÜφ technika umo₧≥ujφcφ jednoznaΦn² pr∙kaz transgenu hpt se osv∞dΦila metoda "nested" PCR, pro nφ₧ byly navr₧eny vlastnφ sestavy primer∙. Uvedenou metodou byla spolehliv∞ prokßzßna p°φtomnost transgenu jak v Φßsti rostlin zφskan²ch z transformaΦnφch pokus∙, tak i semenßΦk∙ z nich odvozen²ch rostlin T2 a T3 generace.

Ze ÜlechtitelskΘho hlediska je zvlßÜt∞ v²znamnΘ zφskßnφ forem se zkrßcenou vegetaΦnφ dobou u genotypu NLN s velmi nφzk²m obsahem kyseliny -linolenovΘ v semenech. Tento genotyp bude vyu₧it ve ÜlechtitelskΘm programu zam∞°enΘm na zφskßnφ ΦeskΘ odr∙dy lnu s olejem vhodn²m k v²rob∞ konzumnφho oleje. U dalÜφho materißlu zφskanΘho po transformaci Φi jako somaklonßlnφ varianty bude v nßsledujφcφch generacφch (T3 a dalÜφch) studovßna d∞diΦnost nalezen²ch odchylek a souΦasn∞ bude testovßn z hlediska jeho vyu₧itelnosti ve Ülecht∞nφ.

Na projektu se podφleli:

Vyu₧itφ transgennφch rostlin lnu v zahraniΦφ

S vyu₧itφm transgenoze byly v Kanad∞ zφskßny linie lnu rezistentnφ k herbicid∙m glyfosßtu (Jordan a McHughen, 1988), sulfonylmoΦovin∞ (Jordan a McHughen, 1988; McHughen, 1989) a fosfinotricinu (McHughen a Holm, 1995a). N∞kterΘ z nich byly po n∞kolik sez≤n odzkouÜeny v polnφch podmφnkßch (McHughen a Holm, 1991; McHughen a Rowland, 1991; McSheffrey et al., 1992; McHughen a Holm, 1995b). Zatφm jedin²mi registrovan²mi transgennφmi odr∙dami lnu jsou cv. CDC Triffid, a cv. CDC Normandy, kterΘ lΘpe snßÜejφ p°φtomnost  reziduφ herbicid∙ typu sulfonylmoΦoviny v p∙d∞ (McHughen et al., 1997, 1999). V mnoha laborato°φch na celΘm sv∞t∞ jsou izolovßny nejr∙zn∞jÜφ geny pro hospodß°sky vyu₧itelnΘ znaky, nep°edpoklßdß se vÜak, vzhledem ke specifiΦnosti plodiny i v²sledk∙m dosa₧en²m konvenΦnφm Ülecht∞nφm, jejich v²razn∞jÜφ uplatn∞nφ v transgen≤zi lnu (krom∞ gen∙ odolnosti k herbicid∙m novΘ generace, tj. v∙Φi p°φrod∞ mΘn∞ nep°ßtelsk²m - ty se urΦit∞ uplatnφ, jakmile budou odr∙dy v²nosov∞ lepÜφ anebo alespo≥ srovnatelnΘ se). P°i Ülecht∞nφ lnu se bezesporu uplatnφ jinΘ izolovanΘ a modifikovanΘ geny specifickΘho ·Φinku, je₧ se podφlejφ p°i vytvß°enφ takov²ch kvalitativnφch znak∙, jak²mi jsou nap°φklad slo₧enφ oleje, charakteristiky stonku a vlßkna, a biologick²ch charakteristik, jako je odolnost k chorobßm a suchu. Zßm∞rem n∞kter²ch autor∙ je u olejnΘho typu lnu docφlit pomocφ transgennφch technik nadprodukce mastn²ch kyselin a zm∞n jejich spektra. JinΘ projekty jsou zam∞°eny na dosa₧enφ zm∞n ve slo₧enφ komponent bun∞ΦnΘ st∞ny a tφm i charakteristik a vlastnostφ vlßkna, zv²Üenφ odolnosti v∙Φi abiotick²m faktor∙m (nap°. zasolenφ p∙dy), jako₧ i vyu₧itφ p°φstup∙ zalo₧en²ch na protismyslov²ch DNA a RNA. TakovΘ projekty byly ji₧ zahßjeny ve Francii, VelkΘ Britßnii, Kanad∞ a Austrßlii.

Literatura:

1. Jordan, M.C., McHughen, A. (1988): Glyphosate tolerant flax plants from Agrobacterium mediated gene transfer. Plant Cell Rep. 7: 281-284.
2. McHughen, A. (1989): Agrobacterium mediated transfer of chlorsulfuron resistance to commercial flax cultivars. Plant Cell Rep. 8: 445-449.
3. McHughen, A., Holm, F. (1991): Herbicide resistant transgenic flax field test: Agronomic performance in normal and sulfonyl-urea containing soil. Euphytica 55: 49-56.
4. McHughen, A., Holm, F.A. (1995a): Development and preliminary field testing of a glufosinate-ammonium tolerant transgenic flax. Can. J. Plant Sci. 75: 117.
5. McHughen, A., Holm, F.A. (1995b): Transgenic flax with environmentally and agronomically sustainable attributes. Transgenic Res. 4: 3-11.
6. McHughen, A., Rowland, G.G. (1991): The effect of T-DNA on the agronomic performance of transgenic flax plants. Euphytica 55: 269-275.
7. McSheffrey, S.A. McHughen, A., Devine, M.D. (1992): Characterization of transgenic sulfonylurea-resistant flax (Linum usitatisimum). Theor. Appl., Genet. 84: 480-486.
8. McHughen, A., Rowland, G.G., Holm, F.A., Bhatty, R.S., Kenaschuk, E.O. (1997): CDC Triffid transgenic flax. Can. J. Plant Sci. 77: 641-643
9. McHughen, A (1999): Transgenic linseed flax (Linum usitatisimum L.). In: Bajaj, Y.P.S. (ed.): Biotechnology in Agriculture and Forestry , Vol. 46. Transgenic Crops 1. Pp. 338-351. Springer Verlag, Berlin.

VybranΘ publikace autor∙ vztahujφcφ se k biotechnologiφm lnu :

1. Rakousk², S., Tejklovß, E., Wiesner, I., Wiesnerovß, D., Kocßbek, T., Ond°ej, M. (1998): T-DNA induced mutations and somaclonal variants of flax. In: Proc. Symp. Bast Fibrous Plants Today and Tomorrow, Breeding, Molecular Biology and Biotechnology Beyond 21st Century. St. Petersburg, Russia, September 28-30 1998, pp. 244-246.
2. Rakousk², S. Tejklovß, E., Wiesner, I., Wiesnerovß, D., Kocßbek, T., Ond°ej, M. (1999): Looking up for new sources of genetic variability in flax using plant biotechnology methods.- In: Book of Abstracts 3rd Int. Symp. Recent Advances in Plant Biotechnology "From Cells to Crops", Starß Lesnß, High Tatras,, Slovak Republic, September 4-10, pp. 90-91, Inst. Plant Genet. & Biotechnol. SAS, Nitra, Slovak Republic.
3. Rakousk², S., Tejklovß, E. (1999): Metody a v²sledky transgenoze lnu (Methods and Prospects of Flax Transgenosis). Czech J. Genet. Plant Breed. 35 (4): 125-129.
4. Rakousk², S., Tejklovß, E., Wiesner, I., Wiesnerovß, D., Kocßbek, T., Ond°ej,  M. (1999): Hygromycin B - an alternative in flax transformant selection. Biol. Plant. 42(3): 361-369.
5. Tejklovß, E. (1990b): L'an.- In: Seman, I. a kol.: BiotechnologickΘ met≤dy v Ül'achtenφ pol'n²ch plodφn. Str. 156-166. Prφroda, Bratislava.
6. Tejklovß, E. (1992): Dlouhodobß kultivace shluk∙ pupen∙ a regenerace rostlin lnu (Linum usitatissimum L.) in vitro. Rostlinnß v²roba (Praha) 28: 1009-1022.