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/ NetNews Usenet Archive 1992 #31 / NN_1992_31.iso / spool / sci / bio / 4716 < prev    next >
Encoding:
Internet Message Format  |  1992-12-29  |  2.5 KB
  1. Path: sparky!uunet!ogicse!das-news.harvard.edu!husc-news.harvard.edu!husc.harvard.edu!robison1
  2. From: robison1@husc10.harvard.edu (Keith Robison)
  3. Newsgroups: sci.bio
  4. Subject: Re: primer walking
  5. Message-ID: <robison1.725605086@husc.harvard.edu>
  6. Date: 29 Dec 92 04:58:06 GMT
  7. Article-I.D.: husc.robison1.725605086
  8. References: <92362.084129U29242@uicvm.uic.edu>
  9. Lines: 54
  10. Nntp-Posting-Host: husc10.harvard.edu
  11.  
  12. Oky.
  13.  
  14. First, the Brookhaven group did NOT invent primer walking -- just
  15. a new twist on it (see one of the most recent Science's for details).
  16.  
  17. The idea of primer walking is that you will sequence a gene in steps --
  18. much like using stepping stones to cross a stream you can't jump.
  19.  
  20. Suppose your DNA of interest looks like:
  21.  
  22. 0)  kkkkkkk????????????????????????????????????????????????????
  23.  
  24. where a "k" represents a block of known sequence, and ???? the unknown
  25. sequence you wish to acquire.  You synthesize a short (~20nt) piece
  26. of DNA which will hybridize within k and provide a free 5' OH group pointing
  27. towards the unknown region, and acquire sequence using dideoxy sequencing:
  28.  
  29.         p--------------->
  30. 1)  kkkkkkk????????????????????????????????????????????????????
  31.  
  32. You have now extended the known region, and so you can repeat the
  33. process until you have "walked" as far as you wish.
  34.  
  35. So what are the problems?  Since you can't make the 2nd primer until
  36. the results are in from the first round (2 days minimum to get data
  37. plus 1 day synth time), you must have many such walking points to get
  38. anywhere quickly. Worse, if one reaction fails you are delayed an extra
  39. round, since that deprives you of the new knowledge (If your stepping
  40. stone falls into an unseen deep spot, you have to find another one and
  41. try again).
  42.  
  43. The Brookhaven group claims to eliminate the delay from the synthesis 
  44. by using 3 6nt sequences lined up end-to-end instead of a custom-synthesized
  45. primer.  The advantage is that someone can synthesize all the possible 6nt
  46. sub-primers and you can draw them from a stock, eliminating the extra day's
  47. wait for the synthesis.  IT DOES NOTHING ABOUT ANYTHING ELSE!  So, failures
  48. still cost you dearly.
  49.  
  50. Another variant on primer walking can be found in:
  51.  
  52. Ohara, O., RL Dorit, W Gilbert.  1989.  PNAS 86:6883-6887.
  53.     Direct genomic sequencing of bacterial DNA: The pyruvate kinase I gene 
  54.     of Escherichia coli.
  55.  
  56. This method is actually being used to completely sequence the genome
  57. of a small bacterium.
  58.  
  59.  
  60. Keith Robison
  61. Harvard University
  62. Department of Cellular & Developmental Biology
  63. Department of Genetics / HHMI
  64.  
  65. robison@biosun.harvard.edu 
  66.