home *** CD-ROM | disk | FTP | other *** search
/ NetNews Usenet Archive 1992 #31 / NN_1992_31.iso / spool / bionet / immunolo / 203 < prev    next >
Encoding:
Internet Message Format  |  1992-12-21  |  3.0 KB
  1. Path: sparky!uunet!biosci!POST.ITS.MCW.EDU!fgarbrec
  2. From: fgarbrec@POST.ITS.MCW.EDU (GARBRECHT)
  3. Newsgroups: bionet.immunology
  4. Subject: Re: ER - resident proteins
  5. Message-ID: <Pine.3.05.9212210832.A3016-c100000@post.its.mcw.edu>
  6. Date: 21 Dec 92 14:40:33 GMT
  7. References: <emu-ct08.cg.1992.1221.103952.n0dax@tuda.ncl.ac.uk>
  8. Sender: daemon@net.bio.net
  9. Distribution: bionet
  10. Lines: 53
  11.  
  12. On Mon, 21 Dec 1992 Mark.OLeary@newcastle.ac.uk wrote:
  13.  
  14. > Date: Mon, 21 Dec 92 10:39:51 GMT
  15. > From:Mark.OLeary@newcastle.ac.uk
  16. > To: GARBRECHT <fgarbrec@post.its.mcw.edu>
  17. > Cc: immunology@net.bio.net
  18. > Subject: Re: ER - resident proteins
  19. > 
  20. > Hi,
  21. >    Thanks for replying to my post. My problem is (and I must phrase this delic
  22. > ately, as I am under a non-disclosure agreement...) that I have an antibody th
  23. > at recognises a common feature of several ER-resident proteins. I wish to conf
  24. > irm its continued activity (I re-generated it from an old stock of the cell li
  25. > ne in storage), and I attempted to do so by lysing some cells, hoping to see
  26. > numerous bands on a western of the lysate when probed using this antibody and
  27. > an alkaline phosphatase-linked secondary ab. This failed. So, I need to know a
  28. >  way to enhance, ER-resident proteins in the mixture I apply to the gel...
  29. > 
  30. > My latest plan is to isolate ER-derived microsomes by sucrose gradient centrif
  31. > ugation, and hope that they retain a good level of their resident proteins.
  32. > 
  33. > I also have another cell line in culture that may be 'leaking' ER-proteins, an
  34. > d I'd like to use the same antibody to check the culture s/n for their presenc
  35. > e, but a simple blot of the s/n doesnt show anything either: I shall have to i
  36. > nvent some concentration protocol that also removes the fetal calf serum compo
  37. > nents as well....
  38. > 
  39. > 
  40. > It seems quite a hard pair of problems to me (I'm just starting my PhD) and th
  41. > ats why I turned to the net for help...
  42. > 
  43. > I hope you can give me a lead or two... 8)
  44.  
  45. As far as concentrating your ER proteins goes, your plan sounds reasonable
  46. to me.  In terms of seeing if your antibody has activity, well, thats another
  47. problem.  Several things come to mind;  first, if the hybridoma is old but
  48. viable, it probably would benefit from re-cloning as hybridomas tend to spit
  49. out chromosomes along the way. (Obviously you need a screening method to
  50. do the recloning.)  Also, check the hybridoma for mycoplasma contamination;
  51. this is a problem in lots of labs, and can lead to poor antibody secretion
  52. in otherwise viable cultures.  It might be helpful to talk to the person who
  53. originally did the fusion for details on their original screening protocol.
  54. The best way to check your detection system for problems would be to run
  55. a control antibody that you know has activity (of the same subclass) against
  56. some other protein known to be expressed by your cell line (or tissue); you
  57. can troubleshoot the assay from there.  Make sure all of your antibody
  58. reagents etc are reasonably fresh and have been stored appropriately.
  59. Good luck,
  60. Fred Garbrecht
  61. Medical College of Wisconsin
  62. fgarbrec@post.its.mcw.edu
  63.  
  64.  
  65.