Slavomír RAKOUSKݹ a Eva TEJKLOVÁ²

¹Ústav molekulární biologie rostlin Akademie věd České republiky, Branišovská 31,
370 05 České Budějovice, Česká republika
² AGRITEC, Výzkum, šlechtění a služby s.r.o., Zemědělská 16,
787 01  Šumperk, Česká republika

 V rámci projektu GA ČR č. 521/97/1135 "Inzerční mutageneze u lnu" se v letech 1997-99 pracoviště Ústavu molekulární biologie rostlin Akademie věd České republiky v Českých Budějovicích a AGRITEC, výzkum, šlechtění a služby s.r.o., Šumperk zabývala problematikou vývoje vlastního postupu přenosu cizích genů do rostlin lnu a možností jeho praktického využití k navození dědičných změn (mutací) potenciálně využitelných ve šlechtění této plodiny. Tento výzkumný záměr byl mimo jiné podmíněn skutečností, že u lnu byly stávající metody přenosu genů prostřednictvím bakterií Agrobacterium tumefaciens málo účinné. Obtížné je zejména vytvoření vhodného systému selekce v prospěch geneticky pozměněných (transformovaných) jedinců.

Vlastním pokusům o přenos cizích genů (transgenozi) předcházelo období, ve kterém byly ověřovány nejvhodnější podmínky pro regeneraci rostlin ze segmentů klíčních rostlin, typy a koncentrace látek (antibiotik) sloužících k následnému odstranění bakterií a látky usnadňující výběr transformantů. Pro vývoj transformační techniky i studium přenosu genů byl zvolen zjednodušený konstrukt začleněný do vektorové bakterie A. tumefaciens, který mimo genu pro rezistenci k antibiotiku hygromycinu (značka umožňující výběr transformovaných rostlin i molekulární důkaz přenosu) obsahoval pouze zesilovací sekvence promotoru 35S. Toto uspořádání umožnilo jednak využít daný konstrukt pro výše zmíněné studijní účely, ale i pro praktické aplikace. Začleňuje-li se totiž odpovídající část vektoru (označovaná jako T-DNA) do rostlinného chromozomu, pak příslušné místo - "gen", kam se zabuduje, často vyřadí z činnosti. To se navenek projeví jako mutace. V tomto případě není tedy třeba k jednorázovému navození dědičné změny v rostlině používat mutagenu (chemické látky, záření). Lze také očekávat, že by spektrum změn mohlo být částečně odlišné od změn navozených klasickou mutagenezí.

Výchozím materiálem byly sterilně vypěstované klíční rostliny lnu. Pro pokusy jsme vybrali zástupce jak olejných typů (odrůda Areco, a novošlechtění NLN 245), tak přadných lnů (odrůda Jitka). V průběhu řešení projektu byla na pracovišti ÚMBR AV ČR vyvinuta nová metodika transformace lnu, jež oproti stávajícím technikám umožňuje účinnější selekci transformantů. V r. 1998 bylo několik set takto získaných rostlin lnu převedeno do zeminy a dále pěstováno ve skleníku, izolovaně od jiných rostlin. V průběhu kultivace rostlin T1/R1 generace nebyly s výjimkou výskytu omezeného počtu jedinců s odchylkami zbarvení a morfologie květních částí a tří linií se sníženou fertilitou pylu nalezeny výraznější morfologické odchylky od rostlin kontroly. Získaná semena byla použita na jaře následujícího roku k výsevu na pole. Hlavní náplní projektu v r. 1999 bylo vyhledávání a charakterizace potenciálně mutantních jedinců v populaci rostlin T2 a R2 generace pěstovaných v polních podmínkách. Pokus byl realizován na pěstebních plochách spoluřešitelského pracoviště AGRITEC Šumperk, s.r.o. Byl založen a veden na základě příslušného povolení Ministerstva životního prostředí. Celkem bylo v polních podmínkách testováno 927 linií odvozených od 3 kultivarů lnu. Vzorky dalších 82 linií s malým počtem jedinců byly pěstovány ve skleníku. V rámci rostlin T2 a R2 generace byly nalezeny odchylky od kontrolních rostlin v barvě květních částí (v různé frekvenci byly zjištěny celkem u 31 linií), barvě a morfologii semen (16/27), v délce větví (14), výšce stonku (4), ranosti (24) a vitalitě pylu (3). U osmi linií byli nalezeni jedinci s částečnými poruchami tvorby zeleného listového barviva - chlorofylu. Celkem bylo popsáno 13 kategorií morfologických odchylek v rámci 127 linií, přičemž některé kategorie odchylek se vyskytovaly společně v rámci téže linie.

V průběhu projektu byla rovněž vyvinuta vlastní metodika izolace deoxyribonukleové kyseliny - DNA z rostlinných pletiv, poskytující DNA v kvalitě využitelné pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Současně byla ověřována vhodnost různých technik detekce transgenu (genu pro hygromycinfosfotransferázu - hpt) v pletivech transformovaných rostlin. Jako nejvhodnější technika umožňující jednoznačný průkaz transgenu hpt se osvědčila metoda "nested" PCR, pro níž byly navrženy vlastní sestavy primerů. Uvedenou metodou byla spolehlivě prokázána přítomnost transgenu jak v části rostlin získaných z transformačních pokusů, tak i semenáčků z nich odvozených rostlin T2 a T3 generace.

Ze šlechtitelského hlediska je zvláště významné získání forem se zkrácenou vegetační dobou u genotypu NLN s velmi nízkým obsahem kyseliny ?-linolenové v semenech. Tento genotyp bude využit ve šlechtitelském programu zaměřeném na získání české odrůdy lnu s olejem vhodným k výrobě konzumního oleje. U dalšího materiálu získaného po transformaci či jako somaklonální varianty bude v následujících generacích (T3 a dalších) studována dědičnost nalezených odchylek a současně bude testován z hlediska jeho využitelnosti ve šlechtění.

Zatím dosažené výsledky byly prezentovány na dvou mezinárodních sympoziích a publikovány ve dvou společných pracech členů řešitelského kolektivu. Současně se staly výchozím bodem mezinárodních spoluprací v rámci sítě AIGM při European Science Foundation a bilaterálních spoluprací. Předpokládáme, že v nejbližší době využijeme v širším měřítku inzerční mutagenezi i u dalších odrůd k indukci mutací využitelných ve šlechtění lnu. Další výzkum v našich laboratořích bude zaměřen na vývoj alternativních technik přenosu cizích genů a vyhledávání genů pro hospodářsky významné znaky.

Na projektu se podíleli:

Využití transgenních rostlin lnu v zahraničí

S využitím transgenoze byly v Kanadě získány linie lnu rezistentní k herbicidům glyfosátu (Jordan a McHughen, 1988), sulfonylmočovině (Jordan a McHughen, 1988; McHughen, 1989) a fosfinotricinu (McHughen a Holm, 1995a). Některé z nich byly po několik sezón odzkoušeny v polních podmínkách (McHughen a Holm, 1991; McHughen a Rowland, 1991; McSheffrey et al., 1992; McHughen a Holm, 1995b). Zatím jedinými registrovanými transgenními odrůdami lnu jsou cv. CDC Triffid, a cv. CDC Normandy, které lépe snášejí přítomnost  reziduí herbicidů typu sulfonylmočoviny v půdě (McHughen et al., 1997, 1999). V mnoha laboratořích na celém světě jsou izolovány nejrůznější geny pro hospodářsky využitelné znaky, nepředpokládá se však, vzhledem ke specifičnosti plodiny i výsledkům dosaženým konvenčním šlechtěním, jejich výraznější uplatnění v transgenózi lnu (kromě genů odolnosti k herbicidům nové generace, tj. vůči přírodě méně nepřátelským - ty se určitě uplatní, jakmile budou odrůdy výnosově lepší anebo alespoň srovnatelné se). Při šlechtění lnu se bezesporu uplatní jiné izolované a modifikované geny specifického účinku, jež se podílejí při vytváření takových kvalitativních znaků, jakými jsou například složení oleje, charakteristiky stonku a vlákna, a biologických charakteristik, jako je odolnost k chorobám a suchu. Záměrem některých autorů je u olejného typu lnu docílit pomocí transgenních technik nadprodukce mastných kyselin a změn jejich spektra. Jiné projekty jsou zaměřeny na dosažení změn ve složení komponent buněčné stěny a tím i charakteristik a vlastností vlákna, zvýšení odolnosti vůči abiotickým faktorům (např. zasolení půdy), jakož i využití přístupů založených na protismyslových DNA a RNA. Takové projekty byly již zahájeny ve Francii, Velké Británii, Kanadě a Austrálii.

Literatura:

1. Jordan, M.C., McHughen, A. (1988): Glyphosate tolerant flax plants from Agrobacterium mediated gene transfer. Plant Cell Rep. 7: 281-284.
2. McHughen, A. (1989): Agrobacterium mediated transfer of chlorsulfuron resistance to commercial flax cultivars. Plant Cell Rep. 8: 445-449.
3. McHughen, A., Holm, F. (1991): Herbicide resistant transgenic flax field test: Agronomic performance in normal and sulfonyl-urea containing soil. Euphytica 55: 49-56.
4. McHughen, A., Holm, F.A. (1995a): Development and preliminary field testing of a glufosinate-ammonium tolerant transgenic flax. Can. J. Plant Sci. 75: 117.
5. McHughen, A., Holm, F.A. (1995b): Transgenic flax with environmentally and agronomically sustainable attributes. Transgenic Res. 4: 3-11.
6. McHughen, A., Rowland, G.G. (1991): The effect of T-DNA on the agronomic performance of transgenic flax plants. Euphytica 55: 269-275.
7. McSheffrey, S.A. McHughen, A., Devine, M.D. (1992): Characterization of transgenic sulfonylurea-resistant flax (Linum usitatisimum). Theor. Appl., Genet. 84: 480-486.
8. McHughen, A., Rowland, G.G., Holm, F.A., Bhatty, R.S., Kenaschuk, E.O. (1997): CDC Triffid transgenic flax. Can. J. Plant Sci. 77: 641-643
9. McHughen, A (1999): Transgenic linseed flax (Linum usitatisimum L.). In: Bajaj, Y.P.S. (ed.): Biotechnology in Agriculture and Forestry , Vol. 46. Transgenic Crops 1. Pp. 338-351. Springer Verlag, Berlin.

Vybrané publikace autorů vztahující se k biotechnologiím lnu :

1. Rakouský, S., Tejklová, E., Wiesner, I., Wiesnerová, D., Kocábek, T., Ondřej, M. (1998): T-DNA induced mutations and somaclonal variants of flax. In: Proc. Symp. Bast Fibrous Plants Today and Tomorrow, Breeding, Molecular Biology and Biotechnology Beyond 21st Century. St. Petersburg, Russia, September 28-30 1998, pp. 244-246.
2. Rakouský, S. Tejklová, E., Wiesner, I., Wiesnerová, D., Kocábek, T., Ondřej, M. (1999): Looking up for new sources of genetic variability in flax using plant biotechnology methods.- In: Book of Abstracts 3rd Int. Symp. Recent Advances in Plant Biotechnology "From Cells to Crops", Stará Lesná, High Tatras,, Slovak Republic, September 4-10, pp. 90-91, Inst. Plant Genet. & Biotechnol. SAS, Nitra, Slovak Republic.
3. Rakouský, S., Tejklová, E. (1999): Metody a výsledky transgenoze lnu (Methods and Prospects of Flax Transgenosis). Czech J. Genet. Plant Breed. 35 (4): 125-129.
4. Rakouský, S., Tejklová, E., Wiesner, I., Wiesnerová, D., Kocábek, T., Ondřej,  M. (1999): Hygromycin B - an alternative in flax transformant selection. Biol. Plant. 42(3): 361-369.
5. Tejklová, E. (1990b): L'an.- In: Seman, I. a kol.: Biotechnologické metódy v šl'achtení pol'ných plodín. Str. 156-166. Príroda, Bratislava.
6. Tejklová, E. (1992): Dlouhodobá kultivace shluků pupenů a regenerace rostlin lnu (Linum usitatissimum L.) in vitro. Rostlinná výroba (Praha) 28: 1009-1022.