5. SEKCE BIOLOGICK▌CH A L╔KA╪SK▌CH V╠D
Seznam anotacφ:
  1. NeobvyklΘ konformace DNA, prodlu₧ovßnφ mikrosatelit∙ a zßkonitosti uspo°ßdßnφ nukleotid∙ v genomech (BF┌)
  2. PreferenΦnφ vazba nßdorovΘho supresoru proteinu p53 na nadÜroubovicovou DNA (BF┌)
  3. NovΘ cytostatikum odvozenΘ od trinukleßrnφch komplex∙ platiny (BF┌)
  4. Diapauza u Chymomyza costata (ENT┌)
  5. Studium vlivu evoluΦnφch mechanism∙ v²b∞ru potravy na  druhovou koexistenci (ENT┌)
  6. Molekulßrn∞-cytogenetickΘ studium evoluce chromoz≤m∙ (ENT┌)
  7. V²zkum ·Φasti nov∞ popsan²ch typ∙ 5-HT receptor∙ v mechanismu neuroimunofarmakologick²ch ·Φink∙ muramylpeptid∙ (FK┌)
  8. Bun∞ΦnΘ mechanismy bolesti vznikajφcφ popßlenφm (FG┌)
  9. Rozdφly mezi r∙stov²mi vlastnostmi hladk²ch svalov²ch bun∞k cΘv u samc∙ a samic a jejich v²znam pro cΘvnφ patologii (FG┌)
  10. Molekulßrnφ mechanismus funkce Na,K-ATPßzy (FG┌)
  11. Nov² typ vrozenΘ poruchy mitochondrißlnφ ATPßzy (FG┌)
  12. Cytolytick² faktor coelomovΘ tekutiny deÜ¥ovek (MB┌)
  13. Model struktury a funkce adenylßt cyklßzovΘho toxinu podφlejφcφho se na patogenicit∞ Bordetella pertussis, p∙vodce ΦernΘho kaÜle (MB┌)
  14. Kombinace biologick²ch a chemick²ch metod p°i dekontaminaci zneΦiÜt∞n²ch slo₧ek ₧ivotnφho prost°edφ (MB┌)
  15. Organizace jadernΘho genomu rostlin (┌EB)
  16. Charakterizace a detekce A a Y vir∙ brambor (┌EB)
  17. ┌Φast polyamin∙ a aromatick²ch monoamin∙ v diferenciaΦnφch pochodech (┌EB)
  18. GliovΘ bu≥ky vytvß°ejφ dif·znφ bariΘry v CNS (┌EM)
  19. ┌loha apoptosy p°i determinaci zubnφho vzorce u myÜi (┌EM)
  20. Vztah zneΦiÜt∞nΘho ovzduÜφ a nitrod∞lo₧nφ r∙stovΘ retardace plodu (┌EM)
  21. Variabilita a molekulßrnφ typizace viru nekrotickΘ krou₧kovitosti slivon∞ a viru zakrslosti slivon∞ na ovocn²ch d°evinßch v ╚R (┌MBR)
  22. Struktura gen∙ bun∞Φn²ch Φßstic rozpoznßvajφcφch signßl pro sekreci bφlkovin u chmelu (┌MBR)
  23. Interakce -tubulinu a Lyn kinßzy v procesu antigennφ aktivace a nßsledn²ch morfologick²ch zm∞n ₧φrn²ch bun∞k (┌MG)
  24. ┌loha onkogennφ bφlkoviny Myb v diferenciaci a proliferaci krevnφch bun∞k (┌MG)
  25. Vliv genotypu na pr∙b∞h imunitnφ reakce proti Leishmania major (┌MG)
  26. Starobylß chromozomovß architektura v oblasti ribosomßlnφch gen∙ (┌ÄFG)
  27. Remodelace jadΘrka v normßlnφch a klonovan²ch embryφch skotu (┌ÄFG)
  28. Hormonßlnφ regulace lipogeneze u p°e₧v²kavc∙ v pr∙b∞hu v²voje (┌ÄFG)
5.1. NeobvyklΘ konformace DNA, prodlu₧ovßnφ mikrosatelit∙ a zßkonitosti uspo°ßdßnφ nukleotid∙ v genomech
V²sledek byl zφskßn p°i °eÜenφ projekt∙ GA AV ╚R A5004802 a GA ╚R 206/98/0626. ╪eÜitel: Jaroslav Kypr
PoΦφtaΦovΘ anal²zy nukleotidov²ch posloupnostφ genom∙ ukßzaly, ₧e mikrosatelity jsou ve v∞tÜin∞ p°φpad∙ jen malou centrßlnφ Φßstφ mnohem delÜφch ·sek∙, kterΘ majφ v²razn∞ nenßhodnΘ vlastnosti. Toto zjiÜt∞nφ naznaΦuje, ₧e mikrosatelity tvo°φ dominantnφ Φßst lidskΘho genomu a ₧e sehrßly klφΦovou ·lohu p°i vzniku eukaryontnφch genom∙. Mikrosatelity se prodlu₧ujφ a nab²vajφ neobvykl²ch konformacφ. Zjistili jsme, ₧e mikrosatelit (TA)n m∙₧e nab²vat neobvyklΘ konformace i v p°φpad∞, kdy je velmi krßtk² a navφc obklopen oblastmi, kterΘ tΘto konformace nenab²vajφ. Mikrosatelit (GA)n nab²vß jinΘ konformace, kterß je jeÜt∞ vφce odliÜnß od dvojitΘ Üroubovice Watsona a Cricka. Stabilizuje ji nap°. metanol nebo dimetylsulfoxid, kter² b∞₧nou DNA denaturuje. Zjistili jsme, ₧e v krystalech jsou stabilizovßny konformace DNA, kterΘ jsou stabilnφ ve vodnΘm trifluoretanolu. Tento poznatek umo₧nφ lΘpe ne₧ dosud vyu₧φvat informacφ, kterΘ poskytuje rentgenstrukturnφ anal²za krystal∙ DNA a molekulßrnφ dynamika. Studie uspo°ßdßnφ nukleotid∙ v genomech ukßzaly, ₧e komplementßrnφ bßze se v genomech shlukujφ, zatφmco dvojice A s C a G s T se vzßjemn∞ kompenzujφ. To je dosud nepoznanß, velice silnß a univerzßlnφ zßkonitost uspo°ßdßnφ nukleotid∙ v genomech, kterou jsme poprvΘ pozorovali v genomech retrovir∙. Dßle jsme z anal²z nukleotidov²ch posloupnostφ genom∙ vyvodili, ₧e krßtkΘ oligonukleotidy lze rozd∞lit do n∞kolika mßlo skupin podle nestejnom∞rnosti jejich rozlo₧enφ v genomech. ExtrΘmnφ nestejnom∞rnost rozlo₧enφ vykazujφ oligonukleotidy, v nich₧ je dinukleotid CpG kombinovßn s C a G. Nestejnom∞rnostφ rozlo₧enφ nukleotid∙ a krßtk²ch oligonukleotid∙ v genomech bude mo₧no vyu₧φt k identifikaci funkΦn∞ v²znamn²ch mφst v genomech a k v²zkumu evoluce genom∙.
  • Matula, M., Kypr, J.: Nucleotide sequences flanking dinucleotide microsatelites in the human, mouse and drosophila genomes. - J. Biomol. Struct. Dyn. 17: 275-280 (1999)
  • Kypr, J.: Prodlu₧ovßnφ DNA a mikrosatelity. - Vesmφr 78: 328-329 (1999)
  • Kypr, J., èt∞pßn, J., Chlßdkovß, J., VorlφΦkovß, M.: Circular dichroism spectroscopy analysis of conformational transitions of a 54 base pair DNA duplex composed of alternating CGCGCG and TATATA blocks. - Biospectroscopy 5: 253-262 (1999)
  • VorlφΦkovß, M., Kejnovskß, I., Kovanda, J., Kypr, J.: Dimerization of the guanine-adenine repeat strands of DNA. - Nucl. Acids Res. 27: 581-586 (1999)
  • Kypr, J., Chlßdkovß, J., Zimulovß, M., VorlφΦkovß, M.: Aqueous trifluorethanol solutions simulate the environment of DNA in the crystalline state. - Nucl. Acids Res. 27: 3466-3473 (1999)
  • Haring, D., Kypr, J.: Correlations and anticorrelations among nucleotide distributions along the genomes of various organisms. - J. Biomol. Struct. Dyn. 17: 267-273 (1999)
  • Haring, D., Kypr, J.: Variations of the mononucleotide and short oligonucleotide distributions in the genomes of various organisms. - J. Theor. Biol. 201: 141-156 (1999)
  • Kypr, J.: Rozlo₧enφ nukleotid∙ v genomech. - Äiva 4: 150-151 (1999)
  • Kypr, J.: Proteiny, proteomy a proteomika. - Äiva 5: 198-200 (1999)
5.2. PreferenΦnφ vazba nßdorovΘho supresoru proteinu p53 na nadÜroubovicovou DNA
V²sledek byl zφskßn p°i °eÜenφ projekt∙ GA ╚R 301/99/0692, GA AV ╚R A5004803 a IGA MZ NC5343-3/1999. ╪eÜitel: Emil PaleΦek
Protein p53 je nßdorov²m supresorem, jeho₧ normßlnφ funkcφ je kontrola bun∞ΦnΘ proliferace. P°i poÜkozenφ bun∞ΦnΘ DNA, kterΘ p°edstavuje potencißlnφ hrozbu nekontrolovanΘho bun∞ΦnΘho d∞lenφ a tedy i vzniku nßdor∙, dokß₧e protein p53 zabrßnit vzniku nßdoru, a to bu∩ zastavenφm bun∞ΦnΘho d∞lenφ na dobu pot°ebnou k oprav∞ DNA nebo zahßjenφm procesu vedoucφho k programovanΘ smrti bu≥ky. Pro tyto pochody jsou interakce proteinu p53 s DNA klφΦovΘ. V BF┌ bylo zjiÜt∞no, ₧e p53 se vß₧e p°ednostn∞ na nadÜroubovicovou DNA.

Byla vÜak prokßzßna i sekvenΦn∞ specifickß vazba p53 na cφlovou sekvenci v lineßrnφch molekulßch DNA; tato vazba p∙sobφ ohyb v DNA. Ionty zinku ve fyziologick²ch koncentracφch inhibujφ vazbu p53 na naÜroubovicovou DNA i na cφlovou sekvenci v lineßrnφ molekule DNA. Vazba p53 na nadÜroubovicovou DNA je mnohonßsobn∞ pevn∞jÜφ ne₧ nespecifickß vazba na linearizovanou DNA; vazby na nadÜroubovicovou DNA se pravd∞podobn∞ ·Φastnφ jak centrßlnφ domΘna proteinu p53, tak i jeho C-koncovß domΘna. Objevenß vazba p53 na nadÜroubovicovou DNA by se mohla podφlet nap°. p°i stabilizaci p53 v bu≥kßch. ╚ßst v²Üe uveden²ch v²sledk∙ vznikla ve spoluprßci s Masarykov²m onkologick²m ·stavem v Brn∞.

  • PaleΦek, E., Vlk, D., Sta≥kovß, V., Brßzda, V., Vojt∞Üek, B., Hupp, T.R., Schaper, A., Jovin, T.M.: Tumor suppressor protein p53 binds preferentially to supercoiled DNA. - Oncogene 15: 2201-2209 (1997).
5.3. NovΘ cytostatikum odvozenΘ od trinukleßrnφch komplex∙ platiny
V²sledek byl zφskßn p°i °eÜenφ projekt∙ GA AV ╚R A5004702, National Institutes of Health (USA) 1R01CA78754-01, Howard Hughes Medical Institute (USA) HHMI 75195-540201 a projektu v rßmci dohody mezi National Science Foundation (USA) a MèMT ╚R ME 152.
Odpov∞dn² °eÜitel: Viktor Brabec
Pomocφ modernφch metod molekulßrnφ biofyziky byly zφskßny v²sledky podporujφcφ zßv∞r, podle kterΘho komplexy platiny ovliv≥ujφcφ strukturnφ a dalÜφ fyzikßlnφ vlastnosti DNA odliÜn²m zp∙sobem ne₧ cisplatina a dalÜφ protinßdorov∞ ·ΦinnΘ komplexy platiny ji₧ zavedenΘ do klinickΘ praxe, mohou vykazovat zlepÜenΘ terapeutickΘ vlastnosti. Toto zjiÜt∞nφ bylo uplatn∞no p°i testovßnφ nov²ch polynukleßrnφch komplex∙ platiny a vedlo k syntΘze novΘho bifunkΦnφho trinukleßrnφho platinovΘho komplexu BBR3464, kter² je v souΦasnΘ dob∞ ve fßzi I klinickΘho zkouÜenφ. Strukturu BBR3464 je mo₧nΘ si nejlΘpe p°edstavit jako spojenφ dvou jednotek trans-[PtCl(NH3)2] pomocφ tetraaminovΘho m∙stku [trans-Pt(NH3)2{H2N(CH2)6NH2}2]2+. Ve spoluprßci s Department of Chemistry, Virginia Commonwealth University v Richmondu bylo provedeno hodnocenφ protinßdorovΘ ·Φinnosti tohoto novΘho komplexu. Bylo zjiÜt∞no, ₧e nov² komplex je protinßdorov∞ ·Φinn² p°i koncentracφch desetkrßt ni₧Üφch ne₧ jsou koncentrace pou₧φvanΘ p°i chemoterapii cisplatinou a jejφch derivßt∙. Je d∙le₧itΘ, ₧e novΘ cytostatikum inhibuje takΘ r∙st lidsk²ch nßdorov²ch bun∞k s mutovan²m genem p53. D∙sledkem tΘto skuteΦnosti je v²razn∞ ÜirÜφ spektrum nßdor∙ citliv²ch v∙Φi p∙sobenφ BBR3464, kterΘ zahrnuje takΘ nßdory rezistentnφ v∙Φi p∙sobenφ platinov²ch cytostatik ji₧ vyu₧φvan²ch v klinickΘ praxi. Poznßnφ mechanismu protinßdorovΘho p∙sobenφ polynukleßrnφch komplex∙ platiny a na jeho zßklad∞ provedenß syntΘza novΘho cytostatika BBR3464 znamenajφ prvnφ zßsadnφ pr∙lom ve v²voji nov²ch platinov²ch cytostatik od objevu protinßdorovΘ ·Φinnosti prvnφho cytostatika tΘto t°φdy, cisplatiny, p°ed t°iceti lety.
  • Brabec, V., KaÜpßrkovß, J., Vrßna, O., Novßkovß, O., Cox, J.W., Qu, Y., Farrell, N.: DNA modifications by a novel bifunctional trinuclear platinum Phase I anticancer agent. - Biochemistry 38: 6781-6790 (1999)
  • KaÜpßrkovß, J., Novßkovß, O., Vrßna, O., Farrell, N., Brabec, V.: Effect of geometric isomerism in dinuclear complexes on DNA interstrand cross-linking. - Biochemistry 38: 10997-11005 (1999)
  • Loskotovß, H., Brabec, V.: DNA interactions of cisplatin tethered to DNA minor groove binder distamycin. - Eur. J. Biochem. 266: 392-402 (1999)
  • Neplechovß, K., KaÜpßrkovß, J., Vrßna, O., Novßkovß, O., Habtemariam, A., Watchman, B., Sadler, P.J., Brabec, V.: DNA interactions of new antitumor aminophosphine platinum(II) complexes. - Mol. Pharmacol. 56: 20-30 (1999)
  • McGregor, T.D., Balcarova, Z., Qu, Y., Tran, M.-C., Äaludovß, R., Brabec, V., Farrell, N.: Sequence-dependent conformational changes in DNA induced by polynuclear platinum complexes. - Inorg. Biochem. 77: 43-46 (1999)
  • Malina, J., Hofr, C., Maresca, L., Natile, G., Brabec, V.: DNA interactions of antitumor cisplatin analogues containing enantiomeric amine ligands. Biophys. J. (1999) in press
  • Brabec, V.: Chemistry and structural biology of 1,2-interstrand adducts of cisplatin. in Platinum-Based Drugs in Cancer Therapy (Kelland LR and Farrell, N., Eds.) Totowa, NJ, Humana Press Inc., 1999, pp 37-61.
  • Balcarovß, Z., KaÜpßrkovß, J., Äßkovskß, A., Novßkovß, O., Sivo, M.F., Natile, G., Brabec, V.: DNA interactions of a novel platinum drug, cis-[PtCl(NH3)2(N7-acyclovir)]+. - Mol. Pharmacol. 53: 846-855 (1998)
  • Äßkovskß, A., Novßkovß, O., Balcarovß, Z., Bierbach, U., Farrell, N., Brabec, V.: DNA interactions of antitumor trans-[PtCl2(NH3)(quinoline)]. - Eur. J. Biochem. 254: 547-557 (1998)
5.4. Diapauza u Chymomyza costata

Anal²zou fotoperiodickΘ reakce u muÜky Chymomyza costata bylo prokßzßno vzßjemnΘ propojenφ biologick²ch hodin, odm∞°ujφcφch dennφ Φas, a biologickΘho kalendß°e, kter² informuje o sez≤nnφm Φase a °φdφ vstup organismu do alternativnφch v²vojov²ch program∙ jako je hmyzφ diapauza (KoÜ¥ßl et al., 2000a). Pomocφ biochemicko-farmaceutick²ch metod bylo zjiÜt∞no, ₧e serotonin je postradateln² v larvßlnφm mozku b∞hem indukce, udr₧ovßnφ i ukonΦovßnφ fotoperiodickΘ diapauzy (KoÜ¥ßl et al., 1999). Obsah dopaminu se m∞nil v pr∙b∞hu dne, maximum bylo dosa₧eno v₧dy po zaΦßtku temnΘ fßze fotoperiody. V²sledky naznaΦily mo₧nou souvislost mezi dennφ fluktuacφ dopaminu a cirkadißnnφm oscilßtorem ovliv≥ujφcφm fotoperiodickou reakci (KoÜ¥ßl et al., 2000b). Klonovali jsme "hodinovΘ" geny period a timeless u muÜky C. costata. Anal²za dennφch rytm∙ jejich exprese a korelace s fenotypem u mutantnφho, nefotoperiodickΘho a arytmickΘho kmene naznaΦila, ₧e protein Timeless by mohl b²t hledan²m spojovacφm Φlßnkem fotoperiodickΘho a cirkadißnnφho ΦasovΘho systΘmu (KoÜ¥ßl & Shimada, 2000).

  • KoÜ¥ßl V., Noguchi H., Shimada K. & Hayakawa Y. (1999) Dopamine and serotonin in the larval CNS of a drosophilid fly, Chymomyza costata: Are they involved in the regulation of diapause? Archives of Insect Biochemistry and Physiology 42, 147-162.
  • KoÜ¥ßl V., Shimada K. & Hayakawa Y. (2000a) Induction and development of winter larval diapause in a drosophilid fly, Chymomyza costata. Journal of Insect Physiology, (in press).
  • KoÜ¥ßl V., Noguchi H., Shimada K. & Hayakawa Y. (2000b) Circadian component influences the photoperiodic induction of diapause in a drosophilid fly, Chymomyza costata. Journal of Insect Physiology, (in press).
  • KoÜ¥ßl V. & Shimada K. (2000) Silence of the timeless gene in the non-photoperiodic-diapause mutants of the drosophilid fly, Chymomyza costata. Insect Biochemistry and Molecular Biology, (submitted).
5.5. Studium vlivu evoluΦnφch mechanism∙ v²b∞ru potravy na  druhovou koexistenci

Jednou ze zßkladnφch otßzek ekologie je snaha o pochopenφ mechanism∙ udr₧ujφcφch vysokou druhovou rozmanitost na Zemi. Uva₧ujeme-li nap°. interakce mezi izolovanou populacφ dravce a jeho ko°isti, logick²m zßv∞rem se zdß b²t stav, kdy dravci vyplenφ svoji ko°ist a nßsledn∞, v d∙sledku nedostatku potravy, sami vyhynou. Je znßma °ada mechanism∙, kterΘ uvedenou modelovou situaci stabilizujφ v ekologickΘ rovnovßze. Tyto mechanizmy vÜak v∞tÜinou nezohled≥ujφ adaptivnφ chovßnφ organizm∙. Dva zßkladnφ modely adaptivnφho chovßnφ popisujφ v²b∞r potravy v homogennφm a nehomogennφm prost°edφ. V prßci Boukal & K°ivan (1999) bylo matematicky dokßzßno, ₧e nerovnom∞rnΘ rozmφst∞nφ potravy v prostoru v n∞kolika potravnφch oblastech a optimßlnφ v²b∞r potravnφ oblasti predßtorem m∙₧e vΘst ke koexistenci dravce a jeho ko°isti ve v²Üe zmφn∞nΘm modelu. V rßmci tΘto druhovΘ koexistence m∙₧e vÜak dochßzet k periodick²m fluktuacφm u obou populacφ. P°φpad, kdy je potrava rozmφst∞na v prostoru rovnom∞rn∞ byl zkoumßn v prßci K°ivan & Sikder (1999). Tato prßce p°edpoklßdala, ₧e krom∞ preferovanΘ potravy se v prostoru nachßzφ jeÜt∞ dalÜφ, alternativnφ potrava. Optimßlnφ chovßnφ konzumenta pak vede k tomu, ₧e pokud hustota preferovanΘ potravy klesne pod jistou minimßlnφ ·rove≥, konzument zahrne i mΘn∞ v²hodnou potravu do svΘho jφdelnφΦku. Z hlediska populaΦnφ dynamiky tento mechanismus op∞t vede k druhovΘ koexistenci vÜech t°φ populacφ.

Teoreticky bylo prokßzßno, ₧e selektivnφ v²b∞r potravy vede ke zv²Üenφ biodiversity. Predace nevede k vyhynutφ preferovanΘ ko°isti, pon∞vad₧ p°i jejφch nφzk²ch hustotßch konzument bu∩ zm∞nφ potravnφ oblast, nebo zahrne do svΘho jφdelnφΦku takΘ alternativnφ potravu. To vede k poklesu predaΦnφho tlaku na primßrnφ potravu a jejφ persistenci v systΘmu.

  • Boukal D. S. & K°ivan V. (1999) Lyapunov functions for Lotka-Volterra predator-prey models with optimal foraging behavior. Journal of Mathematical Biology 39, 493-517.
  • K°ivan V. & Sikder A.(1999) Optimal foraging and predator-prey dynamics II, Theoretical Population Biology 55, 111-126.
5.6. Molekulßrn∞-cytogenetickΘ studium evoluce chromoz≤m∙

FluorescenΦnφ hybridizace in situ (FISH) umo₧≥uje lokalizovat na chromoz≤mech specifickΘ sekvence DNA. Zavedenφ FISH v²znamn∞ p°isp∞lo k poznßnφ fyzick²ch konc∙ chromoz≤m∙, tzv. telomer, kterΘ jsou nezbytnΘ pro stabilitu, ochranu a funkci eukaryotnφch chromoz≤m∙. Telomerickß DNA je tvo°ena bloky opakujφcφch se krßtk²ch, specifick²ch sekvencφ DNA, nap°φklad pro rostliny je typickß sekvence (TTTAGGG)n, u vÜech obratlovc∙ vΦetn∞ Φlov∞ka se univerzßln∞ vyskytuje sekvence (TTAGGG)n. Podobnß sekvence, (TTAGG)n, byla nedßvno izolovßna u bource moruÜovΘho. V pom∞rn∞ rozsßhlΘ fylogenetickΘ studii jsme prokßzali, ₧e TTAGG motiv je p∙vodnφm znakem telomer hmyzu, kter² byl u n∞kter²ch skupin (mouchy, ploÜtice, n∞kterΘ taxony brouk∙) druhotn∞ ztracen a nahrazen jin²m motivem Φi mechanizmem (Sahara et al., 1999).

Evoluci pohlavnφch chromoz≤m∙ jsme studovali pomocφ modifikace FISH, tzv. komparativnφ genomovß hybridizace. Prokßzali jsme vysok² stupe≥ molekulßrnφho rozr∙zn∞nφ mezi chromoz≤my X a Y u Φlov∞ka, myÜi a drozofily, tedy druh∙ s heteromorfnφmi pohlavnφmi chromoz≤my. Naopak absence molekulßrnφch rozdφl∙ mezi genomy samc∙ a samic mouchy Megaselia scalaris signalizujφ rannΘ stadium evoluce pohlavnφch chromoz≤m∙. U mot²l∙ s determinacφ pohlavφ typu WZ bylo mo₧no rozpoznat chromoz≤m W v r∙zn²ch fßzφch meitickΘho i mitotickΘho bun∞ΦnΘho cyklu navzdory nedostatku morfologick²ch rozdφl∙ od ostatnφch chromoz≤m∙. V²sledky ukazujφ, ₧e v evoluci se pohlavnφ chromoz≤my nejprve odliÜujφ na ·rovni DNA a teprve pozd∞ji se mohou odliÜit i morfologicky (Traut et al., 1999).

  • Sahara K., Marec F., Traut W. (1999) TTAGG telomere repeats in chromosomes of some insects and other arthropods. Chromosome Research 7: 449-460.
  • Traut W., Sahara K., Otto T.D., Marec F. (1999) Molecular differentiation of sex chromosomes probed by comparative genomic hybridization. Chromosoma 108: 173-180.
5.7. V²zkum ·Φasti nov∞ popsan²ch typ∙ 5-HT receptor∙ v mechanismu neuroimunofarmakologick²ch ·Φink∙ muramylpeptidu
Jan èevΦφk
NaÜe prßce navazovala a dßle rozÜi°ovala v²sledky projektu, jeho₧ cφlem bylo a je zkoumßnφ interakce mezi imunomodulßtory a nervov²m systΘmem. Ji₧ d°φve jsme sledovali ·Φinek imunomodulßtoru muramyldipeptidu (MDP) na serotonergnφ systΘm za₧φvacφho traktu s p°ihlΘdnutφm k typu z·Φastn∞nΘho serotonergnφho receptoru. V tomto roce jsme se zab²vali mo₧nou interakcφ MDP s 5-HT4 typem. PokraΦuje tak mapovßnφ ·Φinku MDP na jednotliv²ch 5-HT subtypech, kter²ch je dnes znßmo Φtrnßct. V∞tÜinu z nich lze na modelov²ch preparßtech za₧φvacφho traktu zkoumat bez vetÜφch potφ₧φ. NaÜe zjiÜt∞nφ p°inßÜejφ nov² pohled na komplexnost interakce imunomodulßtoru MDP se serotonergnφm systΘmem. Takovßto interakce m∙₧e mφt d∙le₧itΘ d∙sledky, nebo¥ serotonergnφ systΘm je velmi v²znamn²m prost°ednφkem mnoha fyziologick²ch funkcφ organismu. Mapovßnφ ·Φinku MDP na jednotliv²ch 5-HT subtypech je tedy nezbytn²m p°edpokladem pro lepÜφ pochopenφ interakce mezi serotoninem a imunomodulßtory v nervovΘm systΘmu, a m∙₧e tak p°isp∞t ke konstrukci nov²ch typu imunomodulßtoru zbaven²ch ne₧ßdoucφch ·Φink∙.

5.8. Bun∞ΦnΘ mechanismy bolesti vznikajφcφ popßlenφm
V. Vlachovß, A. Lyfenko, I. Dittert, L. Vyklick²
Popßlenφ vyvolßvß u Φlov∞ka nesnesitelnou bolest, kterou nelze odstranit b∞₧n²mi analgetiky a kterß p°edstavuje vß₧n² lΘka°sk² a etick² problΘm. ZakonΦenφ senzorick²ch nervov²ch vlßken specializovan²ch pro signalizaci bolesti jsou na svΘm povrchu vybavena receptory, kterΘ se aktivujφ tepeln²mi podn∞ty. Jejich aktivace je spojena s otev°enφm iontov²ch kanßl∙, vznikem elektrickΘho proudu nap°φΦ povrchovou membrßnou nervovΘho zakonΦenφ a jejφ depolarizacφ. V d∙sledku depolarizace vznikß impulsnφ aktivita, kterß je p°enßÜena do centrßlnφho nervovΘho systΘmu, a na periferii dochßzφ k uvoln∞nφ tachykinin∙, vyvolßvajφcφch neurogennφ zßn∞t. Poda°ilo se objevit novΘ vlastnosti membrßnov²ch elektrick²ch proud∙, na jejich₧ funkci je vznik bolestiv²ch signßl∙ zalo₧en. V rozmezφ teplot 43-53 ░C, kterΘ jsou poci¥ovßny bolestiv∞ jako varovßnφ, ₧e by mohlo dojφt k poÜkozenφ tkßn∞, dochßzφ v p°φsluÜn²ch neuronech ke zhruba dvacetinßsobnΘmu zv²Üenφ proudovΘ odpov∞di. P∙sobenφm vyÜÜφch teplot (>56 ░C) nastßvajφ nevratnΘ zm∞ny: prahovΘ teploty pro aktivaci receptor∙ pak je dosa₧eno ji₧ p°i 25 ░C. Charakterizace membrßnov²ch receptor∙, kterΘ jsou zodpov∞dny za p°enos informace o teplotnφch podn∞tech, umo₧nφ ·ΦinnΘ hledßnφ specifick²ch farmakologick²ch lßtek s perifernφm p∙sobenφm, jimi₧ by bylo mo₧no tlumit bolest v mφst∞ jejφho vzniku. OdhalenΘ vlastnosti membrßnov²ch proud∙ v zodpov∞dn²ch senzorick²ch neuronech a jejich zm∞ny zp∙sobenΘ vyÜÜφmi teplotami vysv∞tlujφ i praktickou zkuÜenost o u₧iteΦnosti rychlΘho ochlazenφ k∙₧e po popßlenφ.

5.9. Rozdφly mezi r∙stov²mi vlastnostmi hladk²ch svalov²ch bun∞k cΘv u samc∙ a samic a jejich v²znam pro cΘvnφ patologii
L BaΦßkovß, V. Lisß, J. KuneÜ, V. MareÜ
V patogenezi atherosklerosy a dalÜφch kardiovaskulßrnφch onemocn∞nφ hraje d∙le₧itou ·lohu aktivace d∞lenφ a migrace hladk²ch svalov²ch bun∞k (HSB) cΘvnφch st∞n. Riziko t∞chto onemocn∞nφ je vyÜÜφ u mu₧∙. P°i studiu HSB v kulturßch odvozen²ch z hrudnφ aorty samc∙ a samic potkana jsme zjistili, ₧e HSB samc∙ migrujφ z explantßt∙ cΘvnφ st∞ny podstatn∞ d°φve, ve vyÜÜφm poΦtu a na delÜφ vzdßlenosti. Ke kultivaΦnφ podlo₧ce p°itom adherujφ menÜφ plochou a slab∞ji. Jejich kultury obsahujφ vφce v°etenovit²ch bun∞k s podΘln∞ uspo°ßdan²mi svazky -aktinov²ch mikrofilament. HSB samc∙ majφ rovn∞₧ kratÜφ mitotick² cyklus, vyÜÜφ r∙stovou frakci, kratÜφ dobu zdvojenφ svΘho celkovΘho poΦtu i vyÜÜφ maximßlnφ populaΦnφ densitu. Na opakovanΘ pasß₧ovßnφ reagujφ podstatn∞ v∞tÜφm zrychlenφm proliferace ne₧ bu≥ky samic, je₧ odpovφdajφ spφÜe vznikem hypertrofie. Mezi projevy hypertrofie HSB samic dominoval vyÜÜφ stupe≥ polyploidizace a vyÜÜφ obsah n∞kter²ch specifick²ch protein∙ (-aktinu, vimentinu a v integrin∙, receptor∙ pro vitronektin a fibronektin), co₧ zßrove≥ sv∞dΦφ i o vyÜÜφm stupni diferenciace t∞chto bun∞k. UvedenΘ rozdφly byly patrnΘ jak u bun∞k isolovan²ch z dosp∞l²ch potkan∙, tak u bun∞k z potkan∙ novorozen²ch a p°etrvßvaly po dobu n∞kolika m∞sφc∙ od jejich p°enosu do kultur s mΘdiem neobsahujφcφm celot∞lov∞ cirkulujφcφ pohlavnφ hormony. Tyto nßlezy sv∞dΦφ o tom, ₧e rozdφlnΘ r∙stovΘ schopnosti HSB jsou determinovßny Φasn∞ ve v²voji a jsou pevn∞ fixovßny na ·rovni genomu. OdliÜn² stupe≥ aktivace hladk²ch svalov²ch bun∞k, nßsledujφcφ po poÜkozenφ cΘvnφ endotelovΘ v²stelky, pravd∞podobn∞ p°edstavuje jednu z p°φΦin Φast∞jÜφho v²skytu hyperplastick²ch reakcφ cΘv u samc∙.
  • BaΦßkovß L. KuneÜ J.: Sex-dependent differences in growth of vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats. Physiol. Res 44: 127-130, 1995.
  • BaΦßkovß L., MareÜ V., Lisß V., Bottone M.-G., Pellicciari C., Kocourek F.: Sex-related differences in the migration and proliferation of rat aortic smooth muscle cells in short and long term culture. In Vitro Cell Dev. Biol.-Anim. 33: 410-413, 1997.
  • BaΦßkovß L., MareÜ V., Lisß V., Kocourek F.: Sex-determined differences in growth and morphology of vascular smooth muscle cells in cultures from newborn rat. Physiol. Res. 46: 403-406, 1997.
  • Loukotovß J., BaΦßkovß L., Zicha J., KuneÜ J.: The influence of angiotensin II on sex-dependent proliferation of aortic VSMC isolated from SHR. Physiol. Res. 47: 501-505, 1998.
  • BaΦßkovß L., Pellicciari C., Bottone M.-G., Lisß V., MareÜ V.: Different responsiveness of male and female rat aortic smooth muscle cells (SMCs) to repeated passaging in culture. Gen. Physiol. Biophys. 18 (Suppl): 56-59, 1999.
  • BaΦßkovß L., MareÜ V., Lisß V.: Gender-related differences in adhesion, growth and differentiation of vascular smooth muscle cells are enhanced in serum-deprived cultures. Cell. Biol. Int., v tisku.
  • BaΦßkovß L., KuneÜ J.: Gender differences in growth of vascular smooth muscle cells isolated from hypertensive and normotensive rats. Clin. Exp. Hypertens., v tisku.
  • BaΦßkovß L., Pellicciari C., Bottone M.-G., Lisß V., MareÜ V.: A sex-related difference in the hypertrophic versus hyperplastic response of vascular smooth muscle cells to repeated passaging in culture. Cell Tissue Res.(odeslßno do tisku).
5.10. Molekulßrnφ mechanismus funkce Na,K-ATPßzy
E. Amler
Na,K-ATPßza je jeden z klφΦov²ch enzym∙ vÜech eukaryotnφch bun∞k (s v²jimkou kvasinek), kter² hraje zßsadnφ roli v °ad∞ zßva₧n²ch lidsk²ch onemocn∞nφ vΦetn∞ hypertenze. Od objevu a prvnφ izolace Na,K-ATPßzy v roce 1957 se dφky znaΦnΘ homologii s p°φbuznou Ca-ATPßzou celosv∞tov∞ p°ijφmalo, ₧e molekulßrnφ mechanismus funkce obou enzym∙ je tΘ₧ podobn². NaÜe nedßvnΘ prßce vÜak ukßzaly, ₧e klasick² uΦebnicov² popis funkce enzymu podle tzv. Albers-Postova modelu je nedostateΦn² a chybn². S vyu₧itφm pokroΦil²ch fluorescenΦnφch technik jsme prokßzali, ₧e Na,K-ATPßza je strukturn∞ heterodimerem a ₧e existence tohoto heterodimeru je nezbytnß i pro funkci enzymu. Objevili jsme existenci dvou vazebn²ch mφst s nφzkou a vysokou afinitou pro ATP, kterß jsou souΦasn∞ p°φtomna na jednΘ a druhΘ alfa-podjednotce heterodimeru. Poda°ilo se nßm prokßzat, ₧e domΘny, na kter²ch je lokalizovßno ATP-vazebnΘ mφsto, jsou v dimerickΘ struktu°e enzymu ve vzßjemnΘ interakci a ₧e tato vazebnß mφsta spolu funkΦn∞ kooperujφ. A₧ dosud obecn∞ p°ijφman² Albers-Post∙v model funkce Na,K-ATPßzy jsme tedy nahradili nov²m modelem molekulßrnφho mechanismu, ve kterΘm se objevuje jako minimßlnφ funkΦnφ jednotka dimer.
  • H. Linnertz, I. Miksik, P. Kvasnicka, E. Bertoli, L. Mazzanti, W. Schoner, E. Amler: Binding of pyrene isothiocyanate to the E ATP site makes the H¡H cytoplasmic loop of Na/K-ATPase rigid. Eur. J. Biochem. 251: 522-527, 1998.
  • I. Konopasek, P. Kvasnicka, P. Herman, H. Linnertz, T. Obsil, J. Vecer, J. Svobodova, K. Strzalka, L. Mazzanti, E. Amler: The origin of the diphenylhexatriene short lifetime component in membranes and solvents. Chemical Physics Letters 293: 429-435, 1998.
  • T. Obsil, F. Merola, A. Lewit-Bentley, E. Amler: The isolated H ¡H cytoplasmic loop of Na,K-ATPase overexpressed in Escherichia coli retains its ability to bind ATP. FEBS Letters 426: 297-300, 1998.
  • H. Linnertz, H. Kost, T. Obsil, A. Kotyk, E. Amler, W. Schoner: Erythrosin 5┤-isothiocyanate labels Cys 549 as part of the low-affinity ATP binding site of Na/K-ATPase. FEBS Letters 441: 103-105, 1998.
  • H. Linnertz, P. Urbanova, T. Obsil, P. Herman, E. Amler, W. Schoner: Molecular distance measurements reveal an ()2 dimeric structure of Na+/K+-ATPase. J. Biol. Chem. 273: 28813-28821, 1998.
  • H. Linnertz, E. Lanz, M. Gregor, R. Antolovic, R. Krumscheid, T. Obsil, J. Slavik, Z. Kovarik, W. Schoner, E. Amler: Microenvironment of the high affinity ATP-binding site of Na,K-ATPase is slightly acidic. Biochem. Biophys. Res. Commun. 254: 215-221, 1999.
  • D. Thoenges, E. Amler, T. Eckert, W. Schoner: Tight binding of bulky fluorescent derivatives of adenosine to the low affinity E2ATP site leads to inhibition of Na,K-ATPase.
  • J. Biol. Chem. 274: 1971-1978, 1999.
5.11. Nov² typ vrozenΘ poruchy mitochondrißlnφ ATPßzy
J. HouÜt∞k
Poruchy enzym∙ oxidativnφ fosforylace p°edstavujφ velkou skupinu zßva₧n²ch metabolick²ch chorob, kterΘ Φasto vedou k progredujφcφmu posti₧enφ nervosvalovΘho aparßtu novorozenc∙ a d∞tφ. Mezi mitochondrißlnφ choroby s obzvlßÜt∞ t∞₧k²m pr∙b∞hem pat°φ defekty mitochondrißlnφ ATPßzy, klφΦovΘho enzymu bun∞ΦnΘ p°em∞ny energie. VÜechny doposud popsanΘ poruchy ATPßzy jsou zp∙sobenΘ maternßln∞ d∞d∞n²mi mutacemi v  podjednotce a, kterß je k≤dovanß mitochondrißlnφ DNA (mtDNA). Jedinou vyjφmku p°edstavuje nov² typ fatßlnφ deficience ATPßzy, kter² jsme objevili ve spoluprßci s Klinikou d∞tφ a dorostu 1. LΘka°skΘ fakulty UK v Praze. Jednß se o selektivnφ snφ₧enφ obsahu ATPßzy na 25% kontrolnφch hodnot ve vÜech tkßnφch, kterΘ mß za nßsledek pokles mitochondrißlnφ tvorby ATP na mΘn∞ ne₧ 15%. Anal²za mtDNA a genetickΘ studie fibroblast∙ a odvozen²ch transmitochondrißlnφch cybrid∙ ukßzaly jadern² p∙vod onemocn∞nφ. Studium mechanismu vzniku onemocn∞nφ pomocφ bichemick²ch a imunochemick²ch metod ukßzalo poruchu tvorby enzymu beze zm∞n v  jeho degradaci. P°φΦinou vzniku ATPßzovΘho defektu je porucha procesu asemblace heterooligomernφho ATPßzovΘho komplexu z  jednotliv²ch podjednotek.
  • Andersson U., HouÜt∞k J., Cannon B.: ATP synthase subunit c expression: physiological regulation of the P1 and P2 genes. Biochem J. 323: 379-385, 1997
  • Floryk D., HouÜt∞k J.: TMRM is suitable for cytofluorometric measurements of changes of mitochondrial membrane potential in cells treated with digitonin. Bioscience Reports 19: 27-34, 1999
  • Antonickß H., Floryk D., Stratilovß L., Klement P., He°manskß J., HouÜ¥kovß H., Zeman J., HouÜt∞k J.: Defective kinetics of cytochrome c oxidase and alteration of mitochondrial membrane potential in fibroblasts and cybrids with MERRF mutation at position 8344 nt. Biochem. J. 342:537-544, 1999
  • HouÜt∞k J, Klement P, Floryk D, Antonickß H, He°manskß J, M. K, Hansφkovß H, HouÜ¥kovß H, Chowdhury SKR, Rosipal S, Kmoch S, Stratilovß L, Zeman J.: A novel deficiency of mitochondrial ATPase of nuclear origin. Hum.Mol.Genetics 8:1967-1974, 1999
5.12. Cytolytick² faktor coelomovΘ tekutiny deÜ¥ovek
Martin Bilej
P°esto₧e bezobratlφ p°edstavujφ p°ibli₧n∞ 95 % ze dvou milion∙ ₧ivoΦiÜn²ch druh∙, naÜe poznatky o obrann²ch mechanismech jsou zalo₧eny p°evß₧n∞ na v²sledcφch zφskan²ch u myÜi a Φlov∞ka. V poslednφch letech se vÜak stßle vφce a vφce objevujφ studie popisujφcφ Φasto unikßtnφ obrannΘ faktory bezobratl²ch s potencißlnφm klinick²m pou₧itφm. Jednou z modelov²ch skupin bezobratl²ch jsou krou₧kovitφ Φervi - deÜ¥ovky.

Ve spoluprßci s belgickou laborato°φ bun∞ΦnΘ imunologie VlßmskΘho meziuniverzitnφho ·stavu pro biotechnologie jsme v coelomovΘ tekutin∞ deÜ¥ovek Eisenia foetida identifikovali nov² cytolytick² faktor nazvan² CCF (Coelomic Cytolytic Factor), kter² vykazuje °adu vlastnostφ podobn²ch savΦφmu faktoru nekrotizujφcφmu tumory (TNF). CCF lyzuje TNF-senzitivnφ nßdorovΘ linie, je secernovßn podobn²m typem bun∞k, p°iΦem₧ se tato sekrece zvyÜuje podobn∞ jako u TNF po podßnφ bakterißlnφch lipopolysacharid∙, je rozpoznßvßn stejn²mi protilßtkami, mß podobn∞ jako TNF opsonizaΦnφ ·Φinky a shodn²m zp∙sobem ovliv≥uje iontovΘ kanßly (antiedemat≤znφ ·Φinky). V∞tÜina t∞chto vlastnostφ je zalo₧ena na shodnΘ lektinovΘ aktivit∞, tedy na interakci se specifick²mi sacharidy. Nejmarkantn∞ji se tato podobnost projevuje v p°φpad∞ trypanolytickΘ aktivity namφ°enΘ proti krevnφm stßdiφm africk²ch trypanosom, parazit∙m zp∙sobujφcφm spavou nemoc u lidφ nebo tzv. naganu u dobytka.

CCF byl ·sp∞Ün∞ klonovßn a rekombinantnφ CCF exprimovan² v bakteriφch si zachovßvß svΘ trypanolytickΘ a cytolytickΘ vlastnosti. P°ekvapiv∞ vÜak nebyla zjiÜt∞na ₧ßdnß sekvenΦnφ homologie mezi CCF a TNF. CCF vykazuje urΦitou homologii s n∞kter²mi proteiny hmyzu a kor²Ü∙, kterΘ se uplat≥ujφ p°i rozpoznßvßnφ mikrobißlnφch polysacharid∙ a p°i jejich eliminaci (tzv. profenoloxidasov² aktivaΦnφ systΘm). Oproti t∞mto protein∙m se vÜak odliÜuje v²razn∞ ÜirÜφ sacharidovou specificitou. Z hlediska zßkladnφho v²zkumu p°edstavujφ tato data v²znamn² p°φklad konvergentnφ evoluce. Navφc CCF a z n∞j odvozenΘ peptidy p°edstavujφ zajφmavou alternativu cytolytickΘho a trypanolytickΘ faktoru v p°φpadech, kdy jsou terapeutickΘ mo₧nosti TNF omezeny vzhledem k jeho toxicit∞.

  • Bilej M., Brys L., Beschin A., Lucas R., Vercauteren E., HanuÜovß R., De Baetselier P.: Identification of a cytolytic protein in the coelomic fluid of Eisenia foetida earthworms. Immunol. Lett. 45, 123-128 (1995).
  • Bilej M., Rossmann P., èinkora M., HanuÜovß R., Beschin A., Raes G., De Baetselier P.: Cellular expression of the cytolytic factor in earthworms Eisenia foetida. Immunol. Lett. 60, 23-29 (1998)
  • Beschin A., Bilej M., Hanssens P., Raymakers J., Van Dyck E., Revets H., Gomez J., Brys L., De Baetselier P., Timmermans M.: Identification and cloning of a glucan- and lipopolysaccharide-binding protein from Eisenia foetida earthworms involved in the activation of prophenoloxidase cascade. J. Biol. Chem. 273, 24948-24954, (1998)
  • Beschin A., Bilej M., Brys L., Torreele E., Lucas R., Magez S., De Baetselier P.: Convergent evolution of cytokines. Nature 400, 627-628 (1999)
5.13. Model struktury a funkce adenylßt cyklßzovΘho toxinu podφlejφcφho se na pathogenicit∞ Bordetella pertussis, p∙vodce ΦernΘho kaÜle.
P. èebo
╚ern² kaÜel je onemocn∞nφ, kterΘ aΦ bylo ve v∞tÜin∞ civilizovan²ch zemφ tΘm∞° vytlaΦeno, p°edstavuje pro rozvojovΘ zem∞ stßle velk² problΘm. Na patogenicit∞ p∙vodce onemocn∞nφ Bordetella pertussis se v²razn∞ podφlφ takΘ adenylßt cyklßzov² toxin (ACT), kter² p°enßÜφ svoji adenylßt cyklßzovou domΘnu p°es membrßnu cφlov²ch bun∞k. DetoxifikovanΘ formy ACT, kterΘ majφ geneticky zruÜenu schopnost syntetizovat cAMP z bun∞Φn²ch zßsob ATP a zabφjet bu≥ky, jsou velmi slibn²m antigenem pro p°φpravu nov²ch rekombinantnφch vakcφn proti ΦernΘmu kaÜli. Pokud je schopnost takto mutovan²ch ACT pronikat do bun∞k zachovßna, lze je pou₧φt jako velmi ·ΦinnΘho dopravce virßlnφch a nßdorov²ch protein∙ do bun∞k prezentujφcφch antigeny a vyvolat u experimentßlnφch zvφ°at imunitnφ odpov∞∩ kterß je ochrßnφ proti n∞kter²m typ∙m vir∙ a nßdor∙. Studium mechanismu pr∙niku ACT bun∞Φnou membrßnou mß proto krom∞ teoretickΘho, takΘ znaΦn² praktick² v²znam pro v²voj zcela novΘ generace ·Φinn²ch a bezpeΦn²ch vakcφn proti zßva₧n²m onemocn∞nφm.

V p°edchozφch letech jsme p°ipravili Üirokou sadu cφlen²ch a inserΦnφch mutant ACT s pozm∞n∞n²mi vlastnostmi, kterΘ byly detailn∞ charakterizovßny v roce 1999. Na zßklad∞ jejich anal²zy byly identifikovßny klφΦovΘ struktury zapojenΘ do translokace ACT p°es membrßnu cφlov²ch bun∞k a navr₧en model interakce ACT s membrßnou (OsiΦkovß et al., 1999). Jako nejzajφmav∞jÜφ se ukßzaly mutanty v oblasti amfipatickΘho -helixu mezi zbytky 502 a₧ 522 molekuly ACT, kter² hraje klφΦovou roli v mechanizmu interakce ACT s bun∞Φnou membrßnou. Substituce glutamßtu 509 za prolinov² zbytek (zφskanß mutanta ACT-Glu509Pro), kter² lßme -helikßlnφ struktury, zcela zruÜφ translokaci AC domΘny do bun∞k, zatφmco neutrßlnφ substitutce glutamßtovΘho zbytku 509 za glutaminov² a valinov² zbytek aktivitu ACT nijak v²razn∞ neovlivnφ. Naopak zm∞na nßboje na zbytku 509 nebo 516 substitucφ lysinu za glutamßtov² zbytek snφ₧φ Φetnost inzerce ACT do membrßny o polovinu a zv²Üφ tvorbu membrßnov²ch kanßl∙ dvakrßt. ┌plnΘ otoΦenφ celkovΘho elektrostatickΘho nßboje -helixu z -2 na +2 po substituci E509K+E516K pak zcela zruÜφ kapacitu ACT translokovat AC domΘnu do bun∞k, snφ₧φ inserci do membrßny o polovinu a zßrove≥ zv²Üφ poΦet iontov²ch kanßl∙ tvo°en²ch ACT asi 10 krßt a drasticky snφ₧φ jejich selektivitu pro kationty. Na zßklad∞ uveden²ch zjiÜt∞nφ jsme navrhli model mechanizmu pr∙niku ACT membrßnou. Ten p°edpoklßdß, ₧e v roztoku existujφ dva vzßjemn∞ se vyluΦujφcφ formy ACT, kterΘ interagujφ ve form∞ monomer∙ ACT s membrßnou odliÜn²m zp∙sobem. Prvnφ se insertuje do membrßny jako translokaΦnφ prekurzor a mß schopnost translokovat AC domΘnu p°es membrßnu bun∞k. Druh² se insertuje do membrßny jako prekurzor membrßnovΘho kanßlu ACT, kter² vznikß oligomerizacφ tohoto prekurzoru v membrßn∞. V dalÜφch letech se zam∞°φme na testovßnφ tohoto modelu n∞kolika paralelnφmi p°φstupy.

  • OsiΦkovß, A., OsiΦka, R., Meyer, E., Benz, R. and P. èebo.: An Amphipathic -helix Including Glutamates 509 and 516 is Crucial for Membrane Translocation of Adenylate Cyclase Toxin and Modulates Formation and Cation Selectivity of Its Membrane Channels. J. Biol. Chem. 274(53), 37644-37650 (1999).
5.14. Kombinace biologick²ch a chemick²ch metod p°i dekontaminaci zneΦiÜt∞n²ch slo₧ek ₧ivotnφho prost°edφ
FrantiÜek Nerud, Ji°φ Gabriel, ╚en∞k Novotn², Vßclav èaÜek
D°evokaznΘ houby, zejmΘna druhy, kterΘ rozklßdajφ lignin (tzv. houby bφlΘ hniloby), se v poslednφch desetiletφch staly p°edm∞tem zßjmu i v oblasti v²voje nov²ch environmentßlnφch biotechnologiφ. Tyto houby produkujφ enzymy schopnΘ rozklßdat, krom∞ ligninu, i jinΘ aromatickΘ polutanty, nap°. polyaromatickΘ uhlovodφky (PAH), polychlorovanΘ bifenyly (PCB), dioxiny, chlorofenoly, syntetickß barviva, aromatickΘ herbicidy apod.

Soustavn² v²zkum fyziologie a biochemie hub v laborato°φch Sektoru ekologie vedl v minul²ch letech k izolaci °ady kmen∙ s v²razn²mi biodegradaΦnφmi schopnostmi. Jako hlavnφ polutanty byly studovßny PAH, PCB a syntetickß barviva. Degradace vybran²ch PAH probφhala na 3 ·rovnφch ¡ v tekutΘm medium, v um∞le kontaminovanΘ zemin∞ a v zemin∞ pochßzejφcφ z lokality dlouhodobΘ zßt∞₧e (mφsta b²valΘ plynßrny v Praze ¡ Michli). V tekutΘm mediu byla srovnßvßna degradaΦnφ schopnost 5 druh∙ hub bφlΘ hniloby (Irpex lacteus, Pleurotus ostreatus, Bjerkandera adusta, Trametes versicolor a Phanerochaete chrysosporium). NejvyÜÜφ degradace byla zjiÜt∞na u I. lacteus (po 14 dnech bylo z media odstran∞no 60% antracenu, 15% fluorantenu a 40% pyrenu). U v²Üe uveden²ch hub byla sledovßna schopnost kolonizovat sterilizovanou a nesterilnφ zeminu. Proto₧e nejrychleji zeminu kolonizoval Irpex lacteus, byl v dalÜφch pokusech pou₧it pouze tento druh. Z um∞le kontaminovanΘ zeminy (50 ppm ka₧dΘho PAH) bylo po 3 m∞sφcφch odstran∞no 49% antracenu, 25% fluorantenu, 52% pyrenu a 37% fenantrenu). Zemina z b²valΘ plynßrny krom∞ PAH obsahovala t∞₧kΘ kovy a kyanidy; p°esto I. lacteus zeminou dob°e pror∙stal a pokles hlavnφch PAH (ve srovnßnφ s p∙dou, kam byla p°idßna tepeln∞ inaktivovanß houba) byl nßsledujφcφ: fenantren ze 141 na 53 ppm, antracen z 29 na 12 ppm, fluoranten z 83 na 74 ppm a pyren ze 118 na 79 ppm. Za dalÜφch 5 t²dn∙ inkubace byl dalÜφ pokles uveden²ch PAH ji₧ jen mal², avÜak toxicita zeminy se snφ₧ila. Z aplikovan²ch ekotoxikologick²ch test∙ byla pozitivnφ korelace mezi poklesem koncentrace PAH (po 10 t²dnech inkubace byla sumßrnφ koncentrace p°ibli₧n∞ 50%) a toxicitou zjiÜt∞na u klφΦivosti semen Brassicasp. (zv²Üenφ ze 40 na 60%) a redukcφ oxidoreduktasovΘ aktivity u Bacillus subtilis (pokles z 58 na 28%). Enzymatickß aktivita I. lacteus po vnesenφ inokula do p∙dy byla potvrzena pomocφ Remazol Brilliant Blue R (antrachinonovΘho barviva strukturßln∞ blφzkΘho PAH), kdy k dekolorizaci barviva (postupn∞ a₧ o 80%) dochßzelo po dobu 6 t²dn∙.

Paraleln∞ se studiem enzymatick²ch degradacφ byla pozornost v∞novßna i Φist∞ chemick²m proces∙m rozkladu r∙zn²ch xenobiotik. Bylo zjiÜt∞no, ₧e systΘmem kov/H2O2 lze v p°φtomnosti urΦit²ch organick²ch medißtor∙ docφlit tak°ka okam₧itΘ degradace xenobiotika. SystΘm, jen₧ je nynφ p°edm∞tem intenzivnφho studia, m∙₧e b²t vhodn²m dopl≥kem resp. p°edstupn∞m bioremediaΦnφch postup∙ aplikovateln²ch v r∙zn²ch odv∞tvφch pr∙myslu.

Mycelium d°evokazn²ch hub obsahuje na svΘm povrchu struktury schopnΘ chemicky poutat ionty t∞₧k²ch kov∙. V roce 1999 byla ·sp∞Ün∞ prokßzßna mo₧nost vyu₧φt mycelißlnφ pelety k sorpci m∞di z modelov²ch roztok∙ i z odpad∙ z galvanizaΦnφch provoz∙. Tato studie navßzala na d°φv∞jÜφ v²zkumy biosorpce kadmia a uranu a potvrdila perspektivnost dalÜφho testovßnφ vlastnostφ d°evokazn²ch basidiomycet∙ i v tΘto oblasti.

  • Bhatt M., Patel M., Rawal B., Novotn² ╚., Molitoris H.P., èaÜek V.: Decolourisation of the synthetic dye RBBR in contaminated soil. World J. Microbiol. Biotechnol. (in press).
  • KrΦmß° P., Kubßtovß A., Votruba J., Erbanovß P., Novotn² ╚., èaÜek V.: Degradation of polychlorinated biphenyls by extracellular enzymes of Phanerochaete chrysosporium produced in perforated plate bioreactor. World J. Microbiol. Biotechnol. 15, 237-242 (1999).
  • Krcmar P., Novotny C., Marais M.-R., Joseleau J.-P.: Structure of extracellular polysaccharide produced by lignin-degrading fungus Phlebia radiata. Internat. J. Biol. Macromolecul. 24, 61-64 (1999).
  • Isikhuemhen O.S., Nerud F.: Preliminary studies of the ligninolytic enzymes produced by the tropical fungus Pleurotus tuber-regium (Fr.) Sing. Antonie van Leeuwenhoek 75, 257-260 (1999).
  • Kubßtovß A., Erbanovß P.: Factors affecting the evaluation of long-term PCB biodegradation in soil by white rot fungi, pp. 141-146 in Ph. Baveye et al. (Eds.) Bioavailability of Organic Xenobiotics in the Environment. Kluywer Academic Publishers, The Netherlands, 1999.
  • Matucha M., Bubner M., Kubßtovß A., Erbanovß P., Uhlφ°ovß H., Novotn² ╚., èaÜek V.: Isotopic labeling in ecological research: Acta Universitatis Carolinae Environmentalis, 1999.
  • Novotn² ╚., Erbanovß P., èaÜek V., Kubßtovß A., Cajthaml T., Lang E., Krahl J., Zadrazil F.: Extracellular oxidative enzyme production and PAH removal in soil by exploratory mycelium of white rot fungi. Biodegradation 10,: 159-168 (1999).
  • èaÜek V., Novotn² C., Erbanovß P., Bhatt M., Cajthaml T., Kubßtovß A., Dosoretz C., Rawal B., Molitoris H.P.: Selection of ligninolytic fungi for biodegradation of organopollutants, pp. 69-74 in A. Leason and B.C. Alleman (Eds.) Phytoremediation and Innovative Strategies for Specialized Remedial Applications. Battelle Press, Columbus-Richland 1999.
5.15. Organizace jadernΘho genomu rostlin
Jaroslav Dole₧el a kol.
V∞tÜina genetickΘ informace rostlin je ulo₧ena v bun∞ΦnΘm jßd°e. Ve srovnßnφ s ostatnφmi eukaryoty lze u rostlin pozorovat znaΦnou variabilitu v mno₧stvφ jadernΘ DNA. Ta je z v∞tÜφ Φßsti zp∙sobena rozdφly v zastoupenφ repetitivnφch sekvencφ DNA v genomu rostlin. P°esto₧e repetitivnφ sekvence nek≤dujφ genetickΘ informace, ovliv≥ujφ strukturu i funkce rostlinnΘho genomu. Proto je studium velikosti genomu a repetitivnφch sekvencφ v²znamnΘ pro pochopenφ evoluce a speciace rostlin. Na druhΘ stran∞ repetitivnφ sekvence znaΦn∞ komplikujφ genetickΘ mapovßnφ v∞tÜiny kulturnφch rostlin, proto₧e p°edstavujφ hlavnφ p°φΦinu obrovskΘ velikosti jejich genom∙. Proto je v souΦasnosti v∞novßna znaΦnß pozornost vyvφjenφ metod anal²zy genomu rostlin na zßklad∞ jeho redukce na jednotlivΘ typy chromosom∙.

V naÜφ laborato°i je studovßna organizace jadernΘho genomu n∞kolika ekonomicky v²znamn²ch plodin. Pomocφ pr∙tokovΘ cytometrie byly zφskßny novΘ poznatky o velikosti jadernΘho genomu u vybran²ch druh∙ a kultivar∙ banßnovnφku (Musa spp.). Jednß se o prvnφ rozsßhlou studii, kterß poskytuje cennß data pro studium genomu na molekulßrnφ ·rovni. Velikost jadernΘho genomu dob°e koreluje se souΦasnou taxonomickou klasifikacφ banßnovnφk∙. Existuje proto p°edpoklad vyu₧itφ pr∙tokovΘ cytometrie pro rychlou identifikaci neznßm²ch klon∙ a hybrid∙ v rßmci Ülechtitelsk²ch program∙ (Lysßk et al. 1999a). Ve spoluprßci s Boyce Thompson Institute (Cornell University) byla z genomu banßnovnφku izolovßna a chromosomßln∞ lokalizovßna novß mobilnφ sekvence DNA. ZφskanΘ v²sledky mohou p°isp∞t k vysv∞tlenφ vzniku a evoluce jednotliv²ch druh∙ a kultivar∙ banßnovnφku (Balint-Kurti et al. 2000). Byla rovn∞₧ vypracovßna p∙vodnφ metoda izolace a t°φd∞nφ mitotick²ch chromosom∙ jeΦmene (Hordeum vulgare) pomocφ pr∙tokovΘ cytometrie. Vyu₧itφ t°φd∞n²ch chromosomov²ch frakcφ usnadnφ a zrychlφ mapovßnφ genomu jeΦmene, zejmΘna prost°ednictvφm konstrukce chromosomov∞ specifick²ch knihoven DNA velk²ch inzert∙ (Lysßk et al. 1999b). Podobn∞ byla ve spoluprßci s MLZU Brno vypracovßna metoda izolace a t°φd∞nφ chromosom∙ smrku (Picea abies) pomocφ pr∙tokovΘ cytometrie. Byla zφskßna frakce chromosomu 1, kterß byla pou₧ita pro konstrukci chromosomov∞ specifickΘ knihovny DNA. Tento unikßtnφ materißl podstatn∞ zjednoduÜφ mapovßnφ rozsßhlΘho genomu smrku.

  • Lysßk M.A., Dole₧elovß M., Horry J.-P., Swennen R., Dole₧el J.: Flow cytometric analysis of nuclear DNA content in Musa. Theor. Appl. Genet. 98: 1344-1350, 1999a.
  • Lysßk M.A., ╚φhalφkovß J., Kubalßkovß M., èimkovß H., Kⁿnzel G., Dole₧el J.: Flow karyotyping and sorting of mitotic chromosomes of barley (Hordeum vulgare). Chrom. Res. 7: 431-444, 1999b.
  • Balint-Kurti P.J., Clendennen S.K., Dole₧elovß M., Valßrik M., Dole₧el J., Beetham P., May G.D.: Identification and chromosomal localization of the Monkey retrotransposon in Musa spp. Mol. Gen. Genet., 2000 (v tisku).
5.16. Charakterizace a detekce A a Y vir∙ brambor
Noemi ╚e°ovskß a kol.
Potyviry reprezentujφ velmi Üirokou skupinu rostlinn²ch patogen∙ s velk²m ekonomick²m dopadem. K nejv²znamn∞jÜφm zßstupc∙m tΘto skupiny pat°φ A a Y viry bramboru. Pro studium vlastnostφ t∞chto vir∙ a jejich diagnostiku jsme p°ipravili sadu monoklonßlnφch protilßtek. Pro detekci A viru bramboru (PVA) byla vypracovßna i metoda polymerßzovΘ °et∞zovΘ reakce (PCR). V poslednφch letech se vyskytla zcela novß skupina izolßt∙ Y viru bramboru (PVY), oznaΦovanß jako PVY-NTN, zp∙sobujφcφ nekr≤zy na hlφzßch. U osmi izolßt∙ tohoto kmene PVY jsme pomocφ monoklonßlnφch protilßtek provedli mapovßnφ spojit²ch epitop∙ (tj. mφst na obalovΘm proteinu viru, na kter²ch dochßzφ k interakci s protilßtkou) a charakterizovali jsme jejich polohu v rßmci obalovΘho proteinu. Dßle byla urΦena nukleotidovß a aminokyselinovß sekvence vysoce variabilnφch N-koncov²ch Φßstφ proteinov²ch obal∙ jednotliv²ch izolßt∙. Velkß homologie v t∞chto sekvencφch u PVY-NTN v porovnßnφ s ostatnφmi kmeny PVY potvrzuje, ₧e tento kmen je evoluΦn∞ nejmladÜφ mezi vÜemi kmeny PVY. ProvedenΘ anal²zy poslou₧φ nejen k objasn∞nφ v²vojov²ch odliÜnostφ a p°φbuznosti mezi kmeny rostlinn²ch vir∙, ale ve spojenφ s imunochemickou anal²zou obalovΘho proteinu PVY-NTN i k vypracovßnφ spolehlivΘho diagnostickΘho rozliÜenφ.
  • ╚e°ovskß N.: Production and characterization of monoclonal antibodies to potato virus YNTN strain and their use in strain differentiation. Plant Pathol. 47: 505-509, 1998.
  • ╚e°ovskß N., Filigarovß M., Moravec T., èubr Z.: Mapping antigenic epitopes of potato virus A using monoclonal antibodies and overlapping synthetic peptides. Can. J. Plant Pathol. 20: 221-226, 1998.
  • ╚e°ovskß N., Petrzik K., Moravec T., Mrßz I.: Potato virus A detection by reverse transcription - polymerase chain reaction. Acta Virologica 42: 83-85, 1998.
  • Moravec T., ╚e°ovskß N., PavlφΦek A.: Electron microscopic observation of potato virus A using monoclonal murine antibodies. Acta Virologica 42: 341-346, 1998.
  • ╚e°ovskß N., Moravec T., Filigarovß M., RyÜlavß H., Grosclaude J.: Partial antigenic characterization of different potato virus Y-NTN isolates with monoclonal antibodies by means of competitive binding tests and immunoblotanalysis. Acta Virologica 43: 391-393, 1999.
5.17. ┌Φast polyamin∙ a aromatick²ch monoamin∙ v diferenciaΦnφch pochodech
Milena Cvikrovß a kol.
Polyaminy (putrescin, spermidin a spermin) p°edstavujφ skupinu alifatick²ch amin∙ p°φtomn²ch ve vÜech ₧iv²ch organismech. Tyto nφzkomolekulßrnφ polykationty se ·Φastnφ ÜirokΘho spektra fyziologick²ch pochod∙ spojen²ch s bun∞Φn²m d∞lenφm, r∙stem a diferenciacφ. Jejich biologickß aktivita je do znaΦnΘ mφry podmφn∞na jejich interakcemi s biomembrßnami a molekulami nukleov²ch kyselin, kterΘ jsou t∞mito vazbami stabilizovßny a ochrßn∞ny p°ed degradacφ. V rostlinn²ch bu≥kßch jsou v²znamn∞ zastoupeny tΘ₧ rozpustnΘ konjugßty polyamin∙ s hydroxysko°icov²mi kyselinami. Polyaminy ovliv≥ujφ spoleΦn∞ s rostlinn²mi hormony °adu diferenciaΦnφch pochod∙ vΦetn∞ indukce kvetenφ, tvorby ko°en∙, somatickΘ embryogeneze a v²voje somatick²ch embryφ. Funkce polyamin∙ a aromatick²ch monoamin∙ (fenyletylamin a tyramin) v t∞chto v²vojov²ch stßdiφch jsou intenzivn∞ studovßny.

Vytvo°ily jsme systΘm, kter² nßm umo₧nil srovnßnφ cytologick²ch zm∞n explantßt∙ vojt∞Üky kultivovan²ch na mΘdiφch indukujφcφch (1) intenzivnφ bun∞ΦnΘ d∞lenφ anebo (2) d∞lenφ pouze omezenΘho poΦtu bun∞k explantßtu, ale jejich v²raznΘ prodlu₧ovßnφ. Zv²Üenφ obsahu voln²ch i konjugovan²ch forem polyamin∙ a aromatick²ch monoamin∙ bylo v²znamn∞ vyÜÜφ v explantßtech s intenzivnφm d∞lenφm bun∞k. Vysokß hladina spermidinu, sperminu a tyraminu je pravd∞podobn∞ nezbytnß pro poΦßteΦnφ v²voj embryφ v intenzφvn∞ se d∞lφcφm explantßtu, zatφmco vyÜÜφ podφl putrescinu byl charakteristick² pro prodlu₧ujφcφ se bu≥ky explantßtu. NaÜe dalÜφ experimenty potvrdily ·Φast spermidinu a jeho rozpustn²ch konjugßt∙ na konverzi somatick²ch embryφ dubu. V nekonvertujφcφch embryφch jsme zjistily naopak vysok² obsah putrescinu, jeho rozpustn²ch konjugßt∙ a vysok² obsah volnΘho fenyletylaminu. R∙st a v²voj je v²sledkem koordinace bun∞ΦnΘho d∞lenφ a dlou₧ivΘho r∙stu, pochod∙ s odliÜn²m po₧adavkem na obsah polyamin∙. Dosa₧enΘ v²sledky rozÜi°ujφ poznatky o ·loze aromatick²ch monoamin∙ a polyamin∙ v regulaci t∞chto proces∙.

  • Cvikrovß M., Malß J., Eder J., Hrubcovß M., Vßgner M.: Abscisic acid, polyamines and phenolic acids in sessile oak somatic embryos in relation to their conversion potential. Plant Physiol. Biochem. 36: 247-253, 1998.
  • Cvikrovß M., Binarovß P., Cenklovß V., Eder J., MachßΦkovß I.: Reinitiation of cell division and polyamine and aromatic monoamine levels in alfalfa explants during the induction of somatic embryogenesis. Physiol. Plant. 105: 330-337, 1999.
  • Cvikrovß M., Binarovß P., Eder J., Vßgner M., Hrubcovß M., Zo± J., MachßΦkovß I.: Effect of inhibition of phenylalanine ammonia lyase activity on growth of alfalfa cell suspension culture: Alterations in mitotic index, ethylene production, and contents of phenolics, cytokinins, and polyamines. Physiol. Plant. 107: 329-337, 1999.
5.18. GliovΘ bu≥ky vytvß°ejφ dif·znφ bariΘry v CNS
Doc. MUDr. Eva Sykovß, DrSc.,
GliovΘ bu≥ky majφ v²znamnou ·lohu nejen p°i udr₧ovßnφ iontovΘ a objemovΘ homeostßzy v CNS, ale tφm, ₧e vytvß°ejφ v mozku dif·znφ barriΘry, zajiÜ¥ujφ i specificitu extrasynaptickΘho p°enosu. Studium tzv. zbytkov²ch K+ proud∙ oligodendrocyt∙ prokßzalo, ₧e v jejich okolφ existuje v∞tÜφ dif·znφ bariΘra, kterß zp∙sobuje zv²ÜenΘ hromad∞nφ K+ v pr∙b∞hu depolarizaΦnφho pulzu a zv²Üen² p°esun K+ p°es membrßnu zp∞t do bu≥ky po ukonΦenφ pulzu, ne₧ u astrocyt∙. Dif·znφ bariΘry v ECP mohou zßsadnφm zp∙sobem ovlivnit sm∞r dif·ze iont∙ a neuroaktivnφch lßtek v nervovΘ tkßnφ. Ukßzali jsme, ₧e poran∞nφ mozku, aplikace draseln²ch iont∙, excitaΦnφch medißtor∙, nebo hypotonickΘho roztoku zp∙sobφ v²znamnΘ zm∞ny dif·znφch parametr∙ extracelulßrnφho prostoru mozku. Dochßzφ k rychlΘmu zmenÜenφ extracelulßrnφho prostoru a zpomalenφ dif·ze neuroaktivnφch lßtek zv²Üenφm dif·znφch p°ekß₧ek, tzv. tortuozity. Po vzniku astrogli≤zy p°etrvßvajφ zv²ÜenΘ hodnoty tortuozity a v bφlΘ hmot∞ navφc dochßzφ k vymizenφ typickΘ dif·znφ anizotropie. NaÜe v²sledky ukßzaly, ₧e astrogli≤za, kterß doprovßzφ poran∞nφ a ΦetnΘ patologickΘ stavy (anoxie, epileptickΘ zßchvaty, demyelinizace, degenerace atp.) je spojena s p°etrvßvajφcφmi zm∞nami dif·znφch parametr∙ extracelulßrnφho prostoru. Tyto nßlezy je mo₧nΘ uplatnit pro diagnostiku n∞kter²ch onemocn∞nφ CNS na p°. pomocφ dif·zn∞-vß₧enΘ magnetickΘ resonance (MR).
  • Chvßtal, A., And∞rovß, M., Äiak, D., Sykovß, E.: Glial depolarization evokes a larger potassium accumulation around oligodendrocytes than around astrocytes in gray matter of rat spinal cord slices. J. Neurosci. Res. 56: 493-505 (1999).
  • Sykovß, E., Vargovß, L., Prokopovß, è., èimonovß, Z.: Glial swelling and astrogliosis produce diffusion barriers in the rat spinal cord. Glia 25: 56-70 (1999).
  • Roitbak, T., Sykovß, E.: Diffusion barriers evoked in the rat cortex by reactive astrogliosis. Glia 28: 40-48 (1999).
5.19. ┌loha apoptosy p°i determinaci zubnφho vzorce u myÜi
MUDr. Miroslav Peterka, CSc
Pomocφ histologick²ch °ez∙ a poΦφtaΦov²ch 3D rekonstrukcφ byla provedena detailnφ anal²za ·lohy apoptosy p°i ΦasnΘm v²voji mandibulßrnφ dentice u myÜφch embryφ. Revidovali jsme obecn∞ uznßvanou p°edstavu o v²voji prvnφho dolnφho molßru (M1) u myÜi. Mohutnß asymetrickß zubnφ liÜta, kterß je dominantnφ epitelovou strukturou v dolnφ Φelisti dvanßctidennφch myÜφch zßrodku (tj. na poΦßtku morfogenese dentice) nenφ jeÜt∞ zßkladem M1, jak se obecn∞ p°edpoklßdß. Tato struktura podlΘhß regresi za ·Φasti apoptosy v jejφm epitelu. Vlastnφ M1 vznikß vφce vzadu a o den pozd∞ji. NaÜe v²sledky ukßzaly, ₧e apoptosa se zßsadnφm zp∙sobem ·Φastnφ p°i determinaci poΦtu, velikosti a polohy Φasn²ch zubnφch primordiφ a jejφ Φaso-prostorov² vzorec hraje jednu z klφΦov²ch ·loh p°i morfogenesi mandibulßrnφho zubnφho epitelu u myÜi. Vzhledem ke skuteΦnosti, ₧e v²voj M1 myÜi je velice Φasto pou₧φvan²m modelem p°i studiφch regulace orgßnovΘho v²voje, sprßvnß reinterpretace v²sledk∙ molekulßrnφch studiφ vzhledem k Φaso-prostorovΘ specificit∞ morfogenetick²ch d∞j∙ p°i v²voji odpovφdajφcφch struktur je z tohoto hlediska velice d∙le₧itß.
  • Lesot, H., Peterkovß, R., Schmitt, R., Meyer, J. M., Viriot, L., Vonesch, J. L., Senger, B., Peterka, M., Ruch, J. V.: Initial features of the inner dental epithelium histo-morphogenesis in the first lower molar in mouse. Int. J. Dev. Biol., 43: 245-254 (1999).
  • Peterkovß, R., Peterka, M., Vonesch, J. L., Ruch, J.V.: Contribution of 3-D computer assisted reconstructions to study of the initial steps of mouse odontogenesis. Journal of Hard Tissue Biology (Spec. Issue): 248-256 (1999).
  • Kieffer, S., Peterkovß, R., Vonesch, J. L., Peterka, M., Ruch, J. V., Lesot, H.: Alterations in the incisor development in the Tabby mouse. Int. J. Dev. Biol. 43: 531-53 (1999).
  • Miard, S., Peterkovß, R., Vonesch, J. L., Ruch, J.V., Peterka, M., Lesot, H.: Morphogenesis of the lower incisor in mouse from bud to early bell stage. Int. J. Dev. Biol. 43: 517-529 (1999).
5.20. Vztah zneΦiÜt∞nΘho ovzduÜφ a nitrod∞lo₧nφ r∙stovΘ retardace plodu.
MUDr. Radim èrßm, DrSc.,
V rßmci Programu Teplice II byly studovßny ·Φinky zneΦiÜt∞nφ ovzduÜφ na v²sledky t∞hotenstvφ v okrese Teplice a Prachatice. Byla prokßzßna asociace relativnφho rizika r∙stovΘ retardace plodu (IUGR) s expozicφ prachov²m Φßsticφm (PM10 a PM2.5) v obdobφ prvΘho m∞sφce t∞hotenstvφ. Asociace s rizikem IUGR byla pozorovßna takΘ u polycyklick²ch aromatick²ch uhlovodφk∙ (PAU) a karcinogennφch PAU v obou lokalitßch. Koncentrace PAU predikuje riziko IUGR lΘpe ne₧ PM10. To nßs vede k vyslovenφ hypotΘzy, ₧e vlastnφ ·Φinnou slo₧kou ve vztahu k riziku IUGR jsou karcinogennφ PAU adsorbovanΘ na povrchu jemn²ch prachov²ch Φßstic. Je mo₧nΘ, ₧e PM a PAU p∙sobφ synergicky. V²sledky dßle naznaΦujφ, ₧e i zv²Üenß expozice SO2 p°ed poΦetφm m∙₧e sni₧ovat plodnost. K ·Φinku SO2 je nejcitliv∞jÜφ druh² m∞sφc p°ed poΦetφm. MultivariaΦnφ anal²za potvrdila v²znam ochrannΘho ·Φinku vitamφnu A a C. Relativnφ rizika r∙stovΘ retardace plodu klesala s r∙stem hladiny vitaminu C v krvi matky. S r∙stem hladiny vitaminu A v krvi matky klesla takΘ pravd∞podobnost nφzkΘ porodnφ hmotnosti a p°edΦasnΘho porodu. V²sledky in vitro test∙ genotoxicity anal²zou DNA adukt∙ a testy embryotoxicity prokßzaly, ₧e karcinogennφ PAU jsou hlavnφ p°φΦinou genotoxickΘ a embryotoxickΘ aktivity organick²ch lßtek vßzan²ch na aerosolovΘ Φßstice.
  • Dejmek, J., Selevan, J. D., BeneÜ, I., Solansk², I., èrßm, J. R.: Fetal growth and maternal exposure to particulate matter during pregnancy. Environ. Health Perspect. 107: 475-480 (1999).
  • èrßm, R.J., Binkovß, B., R÷ssner, P., RubeÜ, J., Topinka, J., Dejmek, J.: Adverse reproductive outcomes from exposure to environmental mutagens. Mutation Research 428: 203-215 (1999).
  • Binkovß, B., Vesel², D., Veselß, D., Jelφnek, R., èrßm, R.J.: Genotoxicity and embryotoxicity of urban air particulate matter collected during winter and summer period in two different districts of the Czech Republic. Mutation Research 440: 45-58 (1999).
5.21. Variabilita a molekulßrnφ typizace viru nekrotickΘ krou₧ko-vitosti slivon∞ a viru zakrslosti slivon∞ na ovocn²ch d°evinßch v ╚R
Dana VaÜkovß, Karel Petrzik, Renata KareÜovß, Josef èpak
V naÜich podmφnkßch majφ z ilarvir∙ d°evin praktick² v²znam pouze virus nekrotickΘ krou₧kovitosti t°eÜn∞ (prunus necrotic ringspot virus - PNRSV), virus zakrslosti Üvestky (prune dwarf virus - PDV) a virus mozaiky jablon∞ (apple mosaic virus). Spektra hostitel∙ t∞chto vir∙ se do znaΦnΘ mφry p°ekr²vajφ - infikujφ t°eÜn∞, viÜn∞, slivon∞, trnky, mirabelky, meru≥ky, broskvon∞, jablon∞, ale i mandlon∞, malinφky, r∙₧e Φi chmel. Tyto viry se Üφ°φ rouby, pylem a v menÜφ mφ°e semeny. P°φznaky infekce ilarviry se liÜφ jak v typech zp∙sobovan²ch poÜkozenφ, tak v intenzit∞, s jakou se napadenφ projevφ. Variabilitu p°φznak∙ ovliv≥ujφ konkrΘtnφ izolßty viru, ale v nemalΘ mφ°e se uplat≥uje i druh a kultivar hostitelskΘ rostliny. N∞kterΘ kmeny PNRSV se mohou podφlet na pozd∞jÜφm dozrßvßnφ plod∙ a na ni₧Üφm vzr∙stu strom∙. Variabilita izolßt∙ mß v²znam pro spolehlivΘ zjiÜt∞nφ p°φtomnosti vir∙ ve stromech metodou ELISA. Protilßtky p°ipravenΘ proti jednomu kmeni viru Φasto nejsou schopnΘ odhalit p°φtomnost kmene mφrn∞ odliÜnΘho. U PNRSV byly zatφm nalezeny t°i sΘrotypy.

Poda°ilo se nßm vytvo°it sbφrku 16 izolßt∙ PNRSV a 11 izolßt∙ PDV pochßzejφcφch z r∙zn²ch hostitel∙ z ·zemφ ╚eskΘ republiky. U vÜech t∞chto izolßt∙ jsme zjistili sekvenci genu bφlkoviny kapsidu, kterß do znaΦnΘ mφry urΦuje nejen sΘrologickΘ, ale i patogennφ vlastnosti danΘho izolßtu.

U viru nekrotickΘ krou₧kovitosti t°eÜn∞ se nßm poda°ilo prokßzat, ₧e virus existuje ve t°ech r∙zn²ch variantßch, ka₧dΘ reprezentovanΘ n∞kolika izolßty, korelujφcφmi s geografick²m p∙vodem viru. V∞tÜina naÜich izolßt∙ je p°φbuznß s jin²mi evropsk²mi izolßty, ale sporadicky se u nßs vyskytujφ i izolßty podobnΘ americk²m.

Naopak v p°φpad∞ viru zakrslosti slivon∞ jsme nenalezli ₧ßdnou souvislost geografickou ani jsme neprokßzali v²znamnΘ odchylky v sekvenci bφlkoviny kapsidu.

Znalost sekvence velkΘho poΦtu mφstn∞ se vyskytujφcφch izolßt∙ nßm umo₧nila navrhnout molekulßrnφ detekΦnφ systΘm, kter² se zv²Üenou citlivostφ zachycuje p°edevÜφm izolßty specifickΘ pro ·zemφ ╚eskΘ republiky.

  • VaÜkovß, D., Petrzik, K., KareÜovß, R.: Variability and molecular typing of the woody-tree infecting prunus necrotic ringspot ilarvirus.- Arch. Virol. 145: 1-11 (2000).
5.22. Struktura gen∙ bun∞Φn²ch Φßstic rozpoznßvajφcφch signßl pro sekreci bφlkovin u chmelu
Jaroslav MatouÜek, V. Junker, LukßÜ Vrba, J. Schubert, J. Patzak, G. Steger
U chmelu byla odhalena d∞diΦn∞ podmφn∞nß prom∞nlivost bun∞Φn²ch Φßstic rozpoznßvajφcφch signßl pro sekreci bφlkovin. Poda°ilo se izolovat a charakterizovat n∞kolik v²znaΦn²ch gen∙ urΦujφcφch ribonukleovou slo₧ku t∞chto Φßstic. V rßmci t∞chto gen∙ byly identifikovßny dva novΘ regulaΦnφ elementy, specifickΘ pro chmel. N∞kterΘ Φßsti charakterizovan²ch gen∙ patrn∞ souvisφ s jejich v²vojem a s evolucφ chmelu. Pomocφ t∞chto gen∙ a nov∞ objeven²ch pseudogen∙ je mo₧nΘ Φesk² chmel odliÜit od jin²ch odr∙d. Krom∞ toho lze tyto funkΦnφ geny tΘ₧ modifikovat a pou₧φt pro p°φpravu rostlin odoln²ch proti r∙zn²m, zejmΘna virov²m patogen∙m. Prßce poprvΘ popisuje toto uspo°ßdßnφ chmelov²ch gen∙ i ₧ivotn∞ d∙le₧it² mechanizmus transportu bφlkovin, kter² je studovßn tΘ₧ u ₧ivoΦich∙ a baktΘriφ.
  • MatouÜek, J., Junker, V., Vrba, L., Schubert, J., Patzak, J., Steger, G.: Molecular characterization and genome organization of 7SL RNA genes from hop (Humulus lupulus L.). - Gene 239: 173-183 (1999).
5.23.Interakce -tubulinu a Lyn kinßzy v procesu antigennφ aktivace a nßsledn²ch morfologick²ch zm∞n ₧φrn²ch bun∞k

ÄφrnΘ bu≥ky jsou v²znamnou komponentou imunitnφho systΘmu a majφ rozhodujφcφ pro rozvoj alergick²ch reakcφ. Aktivace ₧φrn²ch bun∞k vede k uvoln∞nφ histaminu a dalÜφch sekretorick²ch komponent. Aktivace je zahßjena vazbou antigenu (alergenu) na imunoglobulin E (IgE), kter² je zakotven na receptoru pro IgE na povrchu ₧φrn²ch bun∞k. Tato vazba spouÜtφ kaskßdu biochemick²ch pochod∙ v cytoplasm∞, kterΘ vedou k sekreci a produkci regulßtor∙ imunitnφch odpov∞dφ. KlφΦov²m enzymem Φßsn²ch fßzφ aktivace je protein tyrosin kinßza Lyn. P°edpoklßdß se, ₧e enzymy signalizaΦnφ drßhy jsou organizovßny na bun∞ΦnΘ membrßn∞ a na strukturßch bun∞ΦnΘ kostry (cytoskeletu). Jednou ze zßkladnφch komponent cytoskeletu jsou mikrotubuly tvo°enΘ tubuliny, kterΘ se podφlejφ na zm∞nßch tvaru bun∞k p°i jejich aktivaci. Molekulßrnφ podstata mechanism∙ jak se tubuliny ·Φastnφ v t∞chto pochodech jsou vÜak z velkΘ Φßsti neznßmΘ.V prßci je prokßzßno, ₧e u ₧φrn²ch bun∞k existujφ v cytoplazm∞ vysokomolekulßrnφ komplexy protein∙, kterΘ obsahujφ tubuliny, Lyn kinßzu a dalÜφ proteiny fosforylovanΘ na tyrosinu. Aktivace bun∞k vede ke zv²Üenφ fosforylace protein∙ v t∞chto komplexech. V komplexech byl nalezen vedle tubulinov²ch -heterodimer∙, kterΘ vytvß°φ mikrotubuly, takΘ -tubulin, kter² je nutn² k zahßjenφ polymerace mikrotubul∙. Tyto novΘ nßlezy naznaΦily, ₧e -tubulin se ·Φastnφ aktivace ₧φrn²ch bun∞k a ₧e m∙₧e b²t prost°ednφkem mezi Φasn²mi fßzemi antigennφ aktivace a nßsledn²mi zm∞nami v morfologii bun∞k.

  • Drßberovß, L., Drßberovß, E., Surviladze, Z., Drßber, Pe., Drßber, Pa.: Protein tyrosine kinase p53/p56lyn forms complexes with gamma-tubulin in rat basophilic leukemia cells. International Immunology 11: 1829-1839, 1999
5.24. ┌loha onkogennφ bφlkoviny Myb v diferenciaci a proliferaci krevnφch bun∞k

S pou₧itφm kvasniΦnΘho dvouhybridnφho selekΦnφho systΘmu byla identifikovßna bφlkovina ATBF1 jako faktor, kter² se specificky vß₧e na bφlkoviny c-Myb a v-Myb. ATBF1 pat°φ do rodiny multidomΘnov²ch bφlkovin (rodina ZfH/ATBF1), kterΘ se podφlejφ na regulaci exprese genetickΘ informace. Podobn∞ skupina bφlkovin Myb (rodina Myb) se rovn∞₧ ·Φastnφ regulace exprese genetickΘ informace. Jeden Φlen tΘto rodiny, bφlkovina c-Myb, je prokßzan²m v²znamn²m regulßtorem normßlnφho v²voje krevnφch bun∞k a pravd∞podobn∞ se uplat≥uje i v nervovΘ tkßni a v jin²ch tkßnφch. Na druhΘ stran∞, bφlkovina v-Myb je onkogen, vyvolßvajφcφ experimentßlnφ monoblastickou leukemii. V naÜφ prßci bylo ukßzßno, ₧e ATBF1 m∙₧e ovliv≥ovat transkripΦnφ aktivitu bφlkovin Myb, kterß je zßsadn∞ d∙le₧itß pro jejich biologickΘ p∙sobenφ. NedßvnΘ v²sledky zahraniΦnφ laborato°e ukazujφ, ₧e i bφlkovina ZEB, kterß rovn∞₧ pat°φ do rodiny ZfH/ATBF1, ovliv≥uje transkripΦnφ aktivitu bφlkoviny c-Myb. V²sledky zahraniΦnφ i naÜe dohromady poukazujφ na mo₧nost, ₧e bφlkoviny ZfH/ATBF1 a Myb spolupracujφ p°i regulaΦnφch pochodech v²znamn²ch pro v²voj nebo funkci n∞kter²ch tkßnφ.

  • KaÜpar, P., Dvo°ßkovß, M., Krßlovß, J., Pajer, P., Kozmik, Z., Dvo°ßk, M.: Myb-interacting protein, ATBF1, represses transcriptional activity of Myb oncoprotein. J. Biol. Chem. 274: 14422-8, 1999
5.25. Vliv genotypu na pr∙b∞h imunitnφ reakce proti Leishmania major

Prvoci rodu Leishmania p∙sobφ ka₧d² rok tΘm∞° 400000 nov²ch p°φpad∙ leishmani≤z, p°iΦem₧ n∞kolik desφtek mili≤n∙ lidφ je touto chorobou ohro₧eno. S cφlem lepÜφ prevence a lΘΦby tohoto onemocn∞nφ jsme studovali vnφmavost k Leishmania major na modelu rekombinantnφch kongennφch kmen∙ myÜφ sΘrie CcS/Dem, kterΘ vznikly k°φ₧enφm vnφmavΘho kmene BALB/c a rezistentnφho kmene STS. Identifikovali jsme 5 nov²ch genetick²ch lokus∙ Lmr (Leishmania major response) 3-7, kterΘ kontrolujφ imunitnφ odpov∞∩ k L. major. Ka₧d² z t∞chto lokus∙ kontroluje jinou kombinaci patologick²ch a imunologick²ch reakcφ. Zjistili jsme, ₧e v literatu°e postulovanß korelace mezi Th2 typem imunitnφ odpov∞di a chorobou platφ pouze pro urΦitΘ genotypy v lokusech na chromosomech 10 a 17. NaÜe v²sledky ukazujφ v²znamn² vliv genotypu na pr∙b∞h imunitnφch reakcφ, kter² musφ b²t brßn do ·vahy p°i v²b∞ru optimßlnφ individußlnφ terapie.

  • Lipoldovß, M., Svobodovß, M., Krulovß, M., Havelkovß, H., Badalovß, J., Noh²nkovß, E., Holß≥, V., Hart, A. A. M., Volf, P., Demant, P.: Susceptibility to Leishmania major infection in mice: multiple loci and heterogeneity of immunopathological phenotypes. Genes and Immunity, in press
5.26. Starobylß chromozomovß architektura v oblasti ribosomßlnφch gen∙

Ribosomßlnφ RNA (rDNA) geny formujφcφ jadΘrko u ryb a oboj₧ivelnφk∙ jsou charakteristickΘ vysok²m obsahem DNA bohatΘ GC bßzemi - GC heterochromatinem. Tento molekulßrn∞ architektonick² znak z°eteln∞ odliÜuje ni₧Üφ a vyÜÜφ obratlovce, p°ibli₧n∞ Anamniota a Amniota. Dosud vÜak nebylo znßmo, kdy tato charakteristickß asociace heterochromatinu bohatΘho GC bßzemi a ribosomßlnφch gen∙ v evoluci obratlovc∙ vznikla. Molekulßrn∞ cytogenetickß anal²za vlastnostφ a lokalizace ribosomßlnφch gen∙ "₧ivΘ zkamen∞liny" kostlφna americkΘho, Lepisosteus osseus, ukßzala, ₧e u tohoto zßstupce druhΘ nejstarÜφ radiace (Holostei) paprskoploutv²ch ryb (Actinoptergyii) se tato asociace vyskytuje. Proto₧e u prvnφ nejstarÜφ v²vojovΘ v∞tve paprskoploutv²ch, ryb chrupavΦit²ch (Chondrostei) - jeseter∙, takov² heterochromatin v oblasti ribosomßlnφch gen∙ nenφ znßm, je z°ejmΘ, ₧e tento typ heterochromatinu vznikl na ·rovni oznaΦovanΘ jako Neopterygii. Ta zahrnuje kostlφny a ryby kostnatΘ (Teleostei), tedy vÜechny ostatnφ ₧ijφcφ druhy ryb a datuje se do pozdnφho permu.

  • Rßb, P., Rßbovß, M., Reed, K.M., Phillips, R.B., (1999): Chromosomal characteristics of ribosomal DNA in the primitive semionotiform fish, longnose gar Lepisosteus osseus. Chromosome Research 7: 475 - 480.
5.27. Remodelace jadΘrka v normßlnφch a klonovan²ch embryφch skotu

Srovnali jsme zm∞ny v ultrastruktu°e jadΘrka v pr∙b∞hu ΦasnΘho embryonßlnφho v²voje kontrolnφch embryφ skotu a klonovan²ch embryφ skotu. Prßce byla provedena ve spoluprßci s Embryo Technology Center, Danish Inst. of Agricultural Sciences, Dßnsko.

U kontrolnφch embryφ skotu, oplozen²ch in vitro, probφhß aktivace jadΘrka probφhß ve stadiu 8 bun∞k. U klonovan²ch embryφ tato aktivace zaΦφnß na stadiu 4 bun∞k, tedy o jeden bun∞Φn² cyklus d°φve. Tyto v²sledky souhlasφ s naÜimi d°φve publikovan²mi ·daji o syntΘze heterogennφ jadernΘ RNA. Z uvedenΘho vypl²vß, ₧e remodelace jßdra a jadΘrka u klonovan²ch embryφ neopakuje p°esnΘ ΦasovΘ schema normßlnφho v²voje.

  • Ka≥ka, J., Smith, S. D., Soloy, E., Holm, P., & Callesen, H. (1999). Nucleolar ultrastructure in bovine nuclear transfer embryos. Mol. Reprod. Dev., 52(3), 253-263.
5.28. Hormonßlnφ regulace lipogeneze u p°e₧v²kavc∙ v pr∙b∞hu v²voje

Tukovß tkß≥ novorozen²ch p°e₧v²kavc∙ mß strukturu a funkci charakteristickou pro hn∞dou tukovou tkß≥. V reakci na chlad dochßzφ u novorozen²ch k∙zlat ke stimulaci lipol²zy, kterß poskytuje substrßt jak pro p°φmou produkci tepla - net°esovou termogenezi, tak pro t°esovou termogenezi. Mlß∩ata, kterß nemajφ schopnost mobilizovat mastnΘ kyseliny, hynou. Lipogeneze nebyla u novorozen²ch k∙zlat inhibovßna noradrenalinem, isoprenalin vÜak lipogenezi inhiboval. U k∙zlat ve v∞ku 24-32 dnφ ji₧ noradrenalin lipogenezi inhiboval, isoprenalin vÜak byl ·Φinn∞jÜφ ne₧ noradrenalin. OÜet°enφ somatotropinem in vivo nebo in vitro nezv²Üilo schopnost kultivovan²ch explantßt∙ tukovΘ tkßn∞ reagovat na p°φdavek noradrenalinu in vitro, schopnost reagovat na p°φdavek isoprenalinu vÜak byl v²razn∞ zv²Üen. Tyto v²sledky demonstrujφ, ₧e somatotropin zvyÜuje koncentraci in vivo nebo in vitro nerv∙ v adipocytech. Lipogeneze v kultivovan²ch explantßtech tukovΘ tkßn∞ novorozen²ch k∙zlat nebyla ovlivn∞na samotn²m inzulφnem, kortisolem ani somatotropinem. U zvφ°at ve v∞ku 24-32 dnφ samotn² kortisol lipogenezi inhiboval, kombinace inzulφn plus kortisol stimulovala. Inzulφnem a kortisolem stimulovanß lipogeneze byla v explantßtech perirenßlnφ tukovΘ tkßn∞ (nikoliv tkßn∞ omentßlnφ) inhibovßna somatotropinem. InhibiΦnφ ·Φinek somatotropinu na lipogenezi byl v omentßlnφ tukovΘ tkßni demonstrovßn u zvφ°at ve v∞ku 8 m∞sφc∙. Rozdφly ve schopnosti hormon∙ ovliv≥ovat lipogenezi jsou odrazem rozdφln²ch rychlostφ v²vojov²ch zm∞n v tukov²ch depech b∞hem ontogeneze.

  • èkarda J.: Effets of catecholamines in vitro on lipogenesis in cultured adipose tissue from young goats. (1999) J. Vet. Med. A 46: 379-387.
Poslednφ ·prava 30.3.2000 (webmaster)